In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
El pez cebra se perfila como una herramienta poderosa para el estudio de 2,29 enfermedad neuromuscular. Hasta la fecha, el sistema de pez cebra se ha utilizado para validar que causan enfermedades nueva musculares mutaciones 16,17,30, dilucidar nuevos mecanismos patológicos 18, e identificar potencialmente nuevas drogas terapéuticas 12,24. Estos esfuerzos colectivos han establecido la utilidad del pez cebra para modelar enfermedades neuromusculares humanos. Sin embargo, a pesar de los avances realizados con modelos de pez cebra y mamíferos, hay opciones limitadas de tratamiento para los pacientes dentro del amplio espectro de condiciones neuromusculares. Por lo tanto, existe una gran demanda para el desarrollo de la terapia para este grupo de enfermedades devastadoras. Paralelamente a esta demanda para la terapéutica es la correspondiente necesidad de innovación experimental en curso, así como el análisis riguroso para verificar nuevos modelos animales y estrategias terapéuticas putativos.
Análisis EBD se utiliza comúnmente en modelos de ratón detejido estudio y el daño celular en el cerebro, el corazón y el músculo esquelético 27,31. Más notablemente, EBD se utiliza ampliamente en modelos de ratón de diversos subtipos distrofia muscular para mostrar la gravedad de la inestabilidad muscular membrana y dañar 8. El uso de EBD para revelar daño de la membrana muscular es un parámetro de apoyo establecer similitudes del modelo animal para el estado de enfermedad humana 9. El poder de la EBD en el ratón ha llevado a varios laboratorios, incluido el nuestro, para desarrollar y aplicar EBD a los modelos de pez cebra de enfermedad neuromuscular. Debido a la aplicabilidad de análisis EBD, esta técnica se está aplicando activamente para corroborar modelos de pez cebra para el estado de enfermedad humana 11,15,22,24,32. Las larvas con las membranas musculares dañadas tendrá EBD absorción y fluorescencia roja, por lo tanto dentro de las fibras musculares. La fluorescencia observada en el espacio entre las fibras, pero no dentro de las fibras musculares individuales también pueden ser de carácter informativo de las fibras de desprendimiento de la membrana basal en tque la ausencia de daño de la membrana, proporcionando detalles de diagnóstico útil. Análisis EBD tiene aplicación potencial más allá de la validación de modelos animales. Los esfuerzos de nuestro laboratorio han demostrado recientemente que el análisis EBD es beneficioso en la validación de nuevos fármacos potencialmente terapéuticos 24. Determinar si los tratamientos terapéuticos potenciales reducir o abolir EBD captación en modelos de enfermedades neuromusculares puede significar acción terapéutica relevante 8. Este tipo de análisis puede ayudar a establecer el mecanismo (s) de la terapéutica y amplía la aplicación del análisis EBD.
Al igual que con muchas técnicas, análisis EBD tiene varias advertencias que deben observarse durante el diseño y la práctica experimental. Por ejemplo, puede ser un reto para identificar el CCV debido a la engrosamiento del tejido con la edad. Además, es fácil dañar las larvas en la preparación antes y durante la inyección pericárdico, la reducción de los recuentos experimentales y el aumento de la necesidad de preparar un gran número de larvas.Además, el daño físico causado a las larvas durante la manipulación y la inyección podría dar lugar a falsos positivos como el músculo dañado puede tomar hasta EBD. Con el fin de superar algunos de estos obstáculos, hemos descrito una estrategia de co-inyección en este artículo de vídeo que permite la identificación fácil y fiable de las larvas con la infusión de colorante éxito inmediatamente después de la inyección y antes de posterior análisis. La controles co-inyección de FITC-dextrano para inyección éxito al permitir la confirmación de EBD en la vasculatura antes de su absorción por las fibras musculares. Esto puede ser particularmente útil como EBD fluorescencia se vuelve muy difusa en las larvas después de varias horas si no se recoge en las fibras musculares; como tal, puede ser difícil de detectar. Además, falta el CCV y la inyección de EBD en la yema o el cuerpo cavidad puede, después de la incubación, dar lugar a fluorescencia roja difusa similar a controlar embriones, sin embargo, con la reducción de la probabilidad de absorción por las fibras musculares dañadas. Colectivamente, estas cuevasats sugieren inyección EBD requiere paciencia y práctica para lograr resultados consistentes y fiables.
En total, se describe un método práctico y sencillo para realizar el análisis EBD en larvas de pez cebra. Hasta la fecha, el uso del pez cebra como modelo de sistema, sobre todo como modelo de enfermedad humana, se ha expandido rápidamente. Esta expansión se debe en parte al desarrollo continuo y la modificación de las técnicas experimentales que mejoran sobre las ventajas actuales del sistema de pez cebra. La técnica de inyección EBD ofrece una herramienta adicional y potente al arsenal de un investigador para la validación y el estudio de modelos de enfermedad del músculo del pez cebra. La aplicación en curso y la modificación de esta técnica tiene el potencial de ayudar a descubrir nuevas estrategias terapéuticas, así como mecanismos de la enfermedad que causa.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer a Trent Waugh por su asistencia técnica. También reconocemos el Departamento de Pediatría en el Hospital para Niños Enfermos y Cure distrofia muscular congénita (CMD) por su generosa financiación para este proyecto.
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |