转化癌症研究依赖于人体组织的提取。大量工作已投入到优化组织提取方法中 离体 分析。在此，我们描述了可从有限样本中获得最大数据输出的组织处理方法。
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本文内容
摘要
摘要
出于人类福祉的医学研究因需要人体组织和受试者而受到极大限制。然而，在获得人体样本的使用同意后，必须极其谨慎地处理这些珍贵的样本，以最大程度地保持器官、组织和细胞的完整性。遗憾的是，组织处理本身必然涉及将组织从宿主体内取出，这一变化可能引起显著的细胞应激，并对后续分析产生重大影响。这些应激可能导致样本不再能代表其原始取材部位的状态。因此，在处理这些样本时必须严格遵守既定方案，以确保其代表性。同时还必须考虑后续所需的检测类型，以确保采用最适宜的样本处理技术。本文概述了一种组织获取、处理及对处理后组织进行多种分析的方案，旨在从有限的组织样本中最大化地获得下游研究成果。
引言
医学研究极大地受益于对人类细胞系和动物模型的研究。细胞系能够更好地控制系统中的组分，并可使用来自合适生物体的细胞。尽管使用人类细胞更具代表性，但它仅能提供与健康和疾病相关的机制的极度简化的快照，因为细胞系可能无法重现其他细胞、间质成分以及可能影响反应的器官所带来的作用1。另一方面，动物模型虽然在模拟人类疾病和遗传异质性方面并非完全准确，但在大多数模型中能够整合整个动物系统的输入，从而提供更深入的见解2,3。
尽管存在不足，这两种方法各有优势，且互为补充。然而，主要目标仍然是在完整机体的多器官系统中研究人类细胞和器官。因此，转化医学研究在推动对从患者体内提取的人体器官和组织的研究方面已取得显著进展，以更深入地理解疾病背后的机制。转化医学研究的优势在于能够在整个机体及相应细胞中研究治疗效果和疾病影响，从而在细胞实验与动物实验之间实现最佳结合4。
转化医学研究也并非没有缺陷。从患者体内获取的标本一旦离开宿主，便会立即暴露于缺血及其他原本受到保护的外界因素中。这可能导致应激诱导的分子和遗传变化，从而在后续研究中引入偏差。因此，人们已投入大量努力，通过严格的方法提取和处理组织，以最大程度地保持器官和细胞的完整性，用于下游研究5。重要的是，在选择人源样本处理方法时，必须仔细考虑未来的应用方向，因为某些方法可能对特定的细胞组分和信号通路造成损害，而....
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方案
伦理声明：本方案已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心批准。
1. 标本获取
- 从多余的肿瘤组织及相关正常组织中采集科研用组织样本10-12。将标本置于湿冰上保存，以避免自溶。
- 将手术过程中移除的所有组织、医疗器械和异物送至病理科进行必要检查，以协助完成病理诊断。
- 按照适用的科研及组织库管理政策和程序处理用于研究的组织。
注：生物样本采集需要病理科医生、病理技师、组织技术员和组织获取专业人员之间的协调配合。
2. 病理学质量保证（QA）
- 作为早期质量保证措施，完善并核实患者记录，并咨询病理学家以审查诊断性患者记录（病理报告、组织切片等）和组织样本。根据感兴趣的形态学特征（如肿瘤百分比、坏死程度、组织-肿瘤交界区等）对组织样本进行评估。此步骤符合生物样本库最佳实践标准10-12。
- 在生物样本的整个保存期间，完成初步审查后，定期对生物样本库数据和研究样本进行复查。
- 将组织病理学及其他检测的结果和注释与相应样本关联，并通过专有的生物样本库软件系统向研究人员提供这些数据。
注意：质量保证流程可确保生物样本库在临床和技术操作方面的完整性。 - 开展遗传学和分子检测，以验证并表征样本的临床适用性。
- 收集并分析....
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结果
下图展示了对经处理的黑色素瘤肿瘤组织进行广谱免疫表型分析的流式细胞术设门策略。染色当天，组织样本在37 °C、225 RPM振荡条件下，经胶原酶I和DNase I孵育消化60分钟。消化完成后，细胞悬液经70 µm细胞滤网过滤以去除碎片，随后使用荧光标记的流式细胞术抗体对细胞进行染色，以实现免疫细胞表型分析。下文（图3）展示了在MACS缓冲液中于4 °C保存过夜（O/N）的组织样本的设门策略及多种标志物的染色结果。如图所示，按照上述方法处理并置于MACS缓冲液中4 °C过夜保存的样本，细胞死亡率极低。此外，该图表明，采用上述方法处理组织可实现对黑色素瘤肿瘤中免疫细胞亚群的多色广谱表型分析。
图1. 可从人血液和组织样本中开展的分析。
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讨论
最终，样本处理方法的选择应由预期的研究假设以及计划进行的技术检测来决定（图1）。以下部分将简要概述可在此类组织切片上实施的潜在检测方法。该概述并非详尽无遗，而是旨在通过描述各项技术并列出其优缺点，帮助指导样本处理方法及后续检测方案的选择。
流式细胞术染色可对新鲜解剖的组织切片或在4 °C条件下于MACS缓冲液中保存过夜的组织碎片进行。流式细胞术能够对从组织样本中提取的细胞群体进行高特异性的表型分析，可在单个细胞中同时检测多达17种细胞表面标志物以及细胞内蛋白、细胞因子和蛋白酶。此外，某些流式细胞仪具备单细胞放大功能，可用于确定蛋白在细胞内的定位，而不仅限于信号的阳性和强度分析。最后，质谱流式细胞术（mass cytometry）可在同一样本中定量检测超过35种蛋白，但其缺点是细胞必须裂解，因此无法进行后续培养、分选或整体分析14。该技术可实现多种标志物和蛋白的分析，并在单细胞水平上进行详细表征。然而，流式细胞术需要对组织进行均质化处理，导致组织结构的丧失，且必须使用新鲜组织以尽量减少细胞表型的变化。重要的是，用于流式细胞术的组.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了约翰·G·和玛丽·斯特拉·肯尼迪纪念基金会（资助号 #0727033）和黑色素瘤研究联盟的慈善捐助支持。作者谨此感谢德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构组织库（ITB）在组织样本的协调分配与收集以及促进转化研究方面所做的贡献，同时感谢伊格纳西奥·威斯塔巴博士、维克多·普列托博士、MD安德森癌症中心病理科以及黑色素瘤登月计划项目。最后，作者谨向所有受黑色素瘤影响的患者及其家属表示诚挚的感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 针头 | BD | 305167 | |
| 不锈钢一次性手术刀 | Miltex | 4-410 | |
| 组织培养皿 | Corning | 353003 | |
| 活检盒 | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA稳定溶液 | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml 离心管 | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430290 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | StatLab 医疗产品公司 | 28600-5 | |
| 福尔马林容器 | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| 最佳切割温度包埋剂（OCT） | Sakura Finetek | 4583 | |
| 组织-Tek 冷冻模具 | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| 胶原酶 I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm 细胞滤筛 | BD Bioscience | 352350 | |
| 96孔圆底板 | Corning | 3799 | |
| 活/死细胞染色液 | Life Technologies | L34957 |
参考文献
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
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重印与许可
