脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

摘要

我们介绍一种通过向脑核团注射顺行或逆行示踪剂来标记神经元及其突起的技术，该技术使用一种 体外 制备。我们改进了一种现有的i体外 利用荧光标记的小鼠突变体和基础光学设备，通过示踪电穿孔提高标记准确性。

摘要

我们介绍一种结合了 体外 示踪剂注射方案，该方案利用一系列电脉冲和压力脉冲，通过电穿孔增强脑组织外植体对染料的摄取，并在操作过程中采用靶向激光照射及匹配的滤光护目镜。所述技术的 体外 单独使用电穿孔技术即可实现对大脑特定区域相对良好的可视化控制。通过结合激光激发荧光遗传标记物，并利用带通滤光镜眼镜检测其发射信号，可捕获经遗传标记的细胞/细胞核所发出的荧光 和 通过使用荧光示踪染料，研究人员能够更高效地定位目标区域并精确控制注射区域中染料的扩散和摄取，从而显著提高注射的准确性。此外，当GFP表达与特定神经元亚群所表达的神经递质类型相关联时，激光照明技术可提供投射至特定区域的神经元类型信息，从而用于研究特定神经环路的功能特性。

引言

为了定义特定的神经元（微）环路，必须首先确定该环路中的各个参与神经元及其连接模式。自从 Waller 发表关于通过损毁进行神经纤维示踪的研究¹以来，已建立起多种神经解剖学示踪技术。其中一些技术可应用于死后固定的组织^2-4，而另一些则依赖于染料在活神经元中的主动运输，这一现象发现于1971年^5-6。后者可进一步分为两类：一类利用主动逆向运输（从注射区域回溯至某一投射的来源，即投射到该区域的神经元胞体），另一类利用主动顺向运输（从注射区域至某一投射的靶区，即标记神经元的轴突及其终末）。此外，某些情况下将示踪剂注入存活动物体内，动物在注射后可继续存活数天至数周（in vivo 示踪注射）；而在其他情况下，则是对离体脑组织进行注射，并在人工脑脊液中孵育数小时（in vitro 示踪注射）。

在本方案中，我们对现有方法进行了修改 体外 电穿孔技术^7-8 使用霍乱毒素亚基-b和四甲基罗丹明葡聚糖作为示踪物质，在顺行性和逆行性示踪实验中标记神经元胞体及突起。本方案的总体目标是为神经科学家提供一种高效工具，用于追踪不同脑核团之间的神经连接模式，同时利用现有的转基因小鼠品系和基本的光学设备，以提高示踪剂注射过程中的靶向准确性。尽管使用霍乱毒素、葡聚糖胺及其相应的荧光标记结合物进行顺行性和逆行性示踪的方法并非全新技术^9-13 （与电穿孔方法相同， 例如. Haas 等¹⁴），示踪剂注射与电穿孔技术的结合在一种 体外 涉及脑组织块的制备是一种较新的发展⁷与在活体动物中使用相同类型示踪染料的神经元示踪技术相比，其主要优势在于标记强度更高，这是因为电穿孔导入的染料被神经元摄取的效率更高。另一优势是缩短了染料运输所需的孵育时间，且在示踪剂注射过程中具有更高的靶向准确性，因为实验者可直接观察注射靶区。后者还意味着无需使用昂贵的立体定位设备即可定位目标核团或脑区。

为了进一步提高靶向准确性，我们利用了一种转基因小鼠品系，该品系在其甘氨酸能神经元亚群中表达GFP¹⁵，并结合使用基本的光学设备，包括波长为405 nm的手持激光笔和匹配的带通滤光眼镜（450 - 700 nm）。通过荧光信号识别注射区域，并通过观察内源性GFP信号与示踪剂荧光之间的相互作用来更精细地控制示踪剂在注射区域内的扩散范围，从而显著进一步提高了靶向准确性。该技术还可通过识别被示踪剂填充的GFP阳性抑制性神经元（或其他小鼠品系中的兴奋性神经元），同时揭示神经环路的功能及其连接性。

总之，我们进一步改进了一种强大的神经科学研究工具，用于研究脊椎动物大脑的连接组，并评估特定神经回路的不同神经解剖学特征。通过结合使用转基因小鼠以及价格低廉且广泛可用的光学设备，我们显著提高了注射定位的准确性。此外，转基因小鼠使我们能够识别被示踪连接的类型，从而有助于揭示听觉脑干中一个抑制性微环路的功能特性。

方案

1. 光学基因分型

1. 小鼠幼崽的光学基因分型

1. 使用适当激发波长的激光笔（本实验中为 405 nm）和相应的滤光眼镜（阻断激发波长，但透过发射波长，本实验中为 450 - 700 nm）检查相应荧光标记的表达情况。将激光笔照射于幼鼠头部后侧或脊髓部位（见图 1）。避免激光直射眼睛，以及皮肤长时间暴露于激光下。

2. 老年动物的光学基因分型

1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥（120 mg/kg 体重）使小鼠深度麻醉（本实验中使用的小鼠年龄为 p14 至 p138）。通过检查动物的反射来确认麻醉效果（轻捏耳尖或一条后肢以诱发耳朵或腿部的回缩反射）。 
2. 注意：尽管使用了过量戊巴比妥（120 mg/kg 体重），我们仍称该注射操作为"深度麻醉"而非安乐死，因为理想情况下在手术和灌注开始时动物仍存活（即心脏仍在跳动）。这可确保包括脑在内的内脏器官得到更有效的灌注。 
3. 一旦动物不再表现出任何反射，小心地去除覆盖颅骨的皮肤（图 2A），方法是在头部背面的皮肤上做一切口，并剪至颅骨中段。将暴露的颅骨置于激光照射下，并如上所述通过滤光护目镜观察荧光。若观察到阳性 GFP 信号，则进入步骤 2；若未观察到，则通过断头法处死动物 （根据本单位 IACUC 规定，作为第二种/确保性的安乐死方式）。 

注意：在更年老的小鼠（>1 个月）中，可通过动物的眼睛观察到荧光。

2. 经心灌注与脑组织制备

1. 用冰冻的磷酸盐缓冲盐水（PBS；NaCl：137 mM，KCl：2.7 mM，KH₂PO₄：1.5 mM，Na₂HPO₄：8 mM，pH 7.4）进行心脏灌注₂PO₄：1.76 mM，Na₂HPO₄：使用30 G注射器针头以10 mM浓度的溶液灌注，以基本去除动物体内的血液。
   1. 首先，用锋利的剪刀小心地打开肋骨笼，然后将针头插入心脏的左心室。开始向心脏和主动脉泵入 PBS，紧接着用剪刀剪开右心房，以使血液从体内流出。注意：灌注过程需 5 - 10 分钟 根据动物的大小而定。
2. 灌注放血后，将动物断头，在解剖盘中用图钉（或30 G注射器针头）穿过眼眶固定头部，然后从颅骨中取出脑组织。
   1. 首先，使用锋利的剪刀剪除覆盖颅骨的皮肤：在动物头部后方做一小切口，然后沿头部背侧中线剪开，剪至眼睛后方两侧，最后向尾侧方向剪开，完全去除头部后方的皮肤瓣。
   2. 接下来，对颅骨本身重复相同的切割模式，注意在此过程中去除两侧耳蜗，因为这将显著简化最终脑干的取出。完成此步骤后，脑的尾侧半部分应完全暴露。
   3. 下一步，使用锋利的剃须刀片或解剖刀，以约45°角在前脑整体上切开，深度约为2 mm 小脑前方。用弯头刮勺挖出分离出的脑前半部分。
   4. 使用解剖刀在脑的头端抬起其尾侧半部分，随后切断仍与脑干腹侧相连的脑神经。最终，包含脑干在内的脑尾侧半部分应完全脱离已制备的动物头部其余部分。
   5. 将已取出的脑后半部分翻转，以暴露其腹侧面，并在腹侧结构前方（顺行注射用）或后方（逆行注射用）的冠状面上进行切割 "鳞茎" 包含斜方体（见步骤 2.3）。
      1. 始终使用锋利的剃须刀片或解剖刀进行切割操作，以尽量减少因对组织施加过度机械应力而导致的细胞死亡。 最终应获得一个长度约1 cm的脑组织外植体，其中包含完整的上橄榄复合体及其他脑区。

注意：本方案演示了向位于听觉脑干的斜方体进行示踪剂注射的操作步骤。可根据需要调整切面位置和方向以及注射位点。如果目标荧光脑区距离脑表面足够近，能够被识别并直接注射而无需切开脑组织（见图 2B），则可省略冠状切片步骤。

3. 辨认斜方体为两个腹侧明显的"隆起"，其中包含斜方体腹侧核（VNTB）。

注意：有关这些切面大致立体定位坐标的进一步解剖学参考，请参见 Franklin & Paxinos，2008。图谱第78页（前囟约 -5.7 mm）显示斜方体旁正中核（=MNTB）被标记为 "Tz"。第69页显示斜方体腹侧核（VNTB）被标记为 "MVPO"（斜方体旁内腹侧核）¹⁹。

3. 顺行/逆行示踪

注意：所有后续操作均在室温下进行 (25°C)

1. 切割后，将脑干组织块置于含有充氧（95% O₂，5% CO₂）解剖液的制备皿中（NaCl：125 mM，KCl：2.5 mM，MgCl₂：1 mM，CaCl₂：0.1 mM，葡萄糖：25 mM，NaH₂PO₄：1.25 mM，NaHCO₃：25 mM，抗坏血酸：0.4 mM，肌醇：3 mM，丙酮酸：2 mM），并用30 G注射针固定组织块，确保注射区域朝上。
2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制注射电极，并将其填充以下三种溶液之一：a) 1.0 mg/ml 的霍乱毒素B亚基与Alexa荧光染料555偶联的PBS溶液_^12-13 （主要用于逆行运输），b) 1%稀释于0.9%生理盐水中的四甲基罗丹明葡聚糖555（分子量3,000，主要用于逆行运输），或c) 1%稀释于0.9%生理盐水中的10,000分子量葡聚糖-TRITC 555（主要用于顺行运输）。
   1. 确保注射电极的电阻在2.5至3.5 MΩ之间，并通过3–4次拉制循环完成制备。在本实验中，可通过选择程序化拉制程序的电极拉制仪实现该参数。
3. 使用固定安装的适当波长激光笔照射脑组织块（图 3A中的第2项；本实验中使用波长为405 nm的激光）。利用激光作为注射引导，将光束对准拟注射的荧光标记脑核团或目标细胞。
4. 佩戴匹配的滤光护目镜（本实验中使用450–700 nm带通滤光片），通过双目显微镜观察被激光照射的目标区域。通过显微操作器将注射电极插入目标区域。
5. 注射示踪物质。使用压力注射装置，向脑片内目标区域（ROI）垂直施加2–10次压力脉冲，每次压力为15 psi，持续50毫秒。每次压力脉冲间隔10–15秒，以允许染料扩散。
6. 对于四甲基罗丹明（TRITC）注射，还需进行电刺激，通过电穿孔增强染料摄取，电极置于目标脑区（本实验中为MNTB和VNTB）。
   1. 使用刺激器输出8个TTL脉冲，每个脉冲8伏特，持续50毫秒，脉冲间间隔50毫秒，并通过刺激隔离单元放大至55 V（图 3B中的第7项和第9项）。重复该刺激程序10–20次，持续数分钟^7,8。确保电极正确接地——接地线应连接至浴液！
7. 检查注射是否成功。由于发射波长较长的荧光示踪剂在短波长激光激发下也会产生荧光信号，因此可在激光照射目标区域的同时，通过滤光护目镜观察注射区域是否有染料摄取或扩散，以直观判断注射效果。

4. 孵育

1. 注射后，将脑干置于充氧的人工脑脊液（ACSF；NaCl：125 mM，KCl：2.5 mM，MgCl₂：1 mM，CaCl₂：2 mM，葡萄糖：25 mM，NaH₂PO₄：1.25 mM，NaHCO₃：25 mM，抗坏血酸：0.4 mM，肌醇：3 mM，丙酮酸：2 mM，用95% O₂ - 5% CO₂ 混合气体饱和）中，在室温（RT， 25°C）孵育1–4小时，以使染料完成运输。在整个孵育期间持续向溶液中通入混合气体。
2. 随后，将脑干转移至含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS，约100 ml；PFA/PBS混合液pH为7）中，并在4°C下孵育过夜（O/N），以完成后固定。

5. 组织切片与封片

1. 第二天，用 PBS 清洗脑干三次（每次清洗 5 分钟），将其包埋于 4% 琼脂中，然后在振动切片机上切成 50 - 80 μm 厚的切片。使用封片剂将切片固定在载玻片上，并加盖盖玻片。
2. 可选步骤：用荧光尼氏染色液对切片进行染色，孵育 25 分钟（例如，将蓝色尼氏染料以 1:100 的比例稀释于 AB 溶液中）。
   1. 配制 AB 溶液：混合 250 ml 0.2 M 磷酸缓冲液（PB；含 51 mM KH₂PO₄、150 mM Na₂HPO₄）、15 ml 5 M NaCl、15 ml 10% Triton-X、220 ml ddH₂O 和 5 g 牛血清白蛋白。
   2. 尼氏染色前后均需用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。

注意：在需要安装和分析较厚切片的情况下（本实验中所述切片厚度为 100 - 500 微米，以在较长距离上保留轴突连接），该技术可与组织透明化方法结合使用。我们发现 ClearT2¹² 具有良好效果²⁰。当包含组织透明化步骤时，应在安装切片前完成该步骤。

结果

图1和图2 展示如何使用激光笔和激光护目镜快速且低成本地从一窝幼鼠中鉴定出GFP阳性个体。对于幼龄小鼠，该技术可非侵入性地透过颅骨和表层皮肤识别动物脑内的GFP标记。图 1A - D）。出生后第3天的小鼠幼崽，其皮肤和颅骨下发出的荧光仍可被观察到（图 1C）。该操作步骤如图所示 图1 对于表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠品系（GlyT2-GFP），其神经元中的甘氨酸能亚群被GFP标记。在年龄较大的动物中，由于颅骨较厚且皮肤有色素沉着，GFP标记透过皮肤和骨骼的可见度较低，因此在进行光学基因分型前，需要去除头部和/或颈部的皮肤。图 2A).

灌注动物后，取出脑组织并再次观察荧光标记的特定细胞核。在图2B中，脑干腹侧表面附近发亮的明亮结构为两个斜方体腹侧核，我们将其作为示踪剂注射的定位参考和靶点。图4和图5展示了向斜方体腹侧核（VNTB）进行顺行...

讨论

一种普遍的优势 体外 示踪电穿孔，与之相对的是 在 体内 示踪研究的优势在于，它使研究人员能够更便捷地接触目标脑区，因此无需使用昂贵的立体定位（以及通常所需的电生理）设备。此外，脑组织离体样本所需的存活时间仅为数小时（1–4小时），而相比之下，活体动物示踪实验通常需要数天甚至数周的存活期。 体内 示踪剂注射（参见关于葡聚糖胺及其他示踪剂使用的详细综述） 体内 Lanciego 和 Wouterlood，2011 年的注射方法²²，但也包括Rodriguez-Contreras， 等, 2008²³），以便在注射过程中或最迟在次日即可发现注射失败的情况，从而相应地调整注射参数。脑组织外植体的存活时间较短，也意味着通常在不同组别之间的差异较小 有效 （染料被神经元摄取的区域，在顺行注射中标记轴突末梢，或在逆行注射中标记轴突终末）以及 表观的 （染料溢出但未被吸收的区域）注射部位，尽管这种差异永远无法完全排除，且只能在事后进行量化或控制，在某些情况下甚至完全无法实现...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	所有化学品均来自 Sigma-Aldrich，另有说明者除外。
氯化钾		P9333
磷酸二氢钾		P5655
磷酸氢二钠		S907
氯化镁		M2670
氯化钙		C5080
葡萄糖		G7528
碳酸氢钠		S6297
抗坏血酸		A4544
肌醇		I5125
丙酮酸钠		P2256
牛血清白蛋白		A2153	可选，用于额外的（免疫）组织化学染色
吐温-100		X100	可选，用于脑组织透明化
聚乙二醇，分子量 8000		P2139	可选，用于脑组织透明化
甲酰胺	Fisher Scientific	F84	可选，用于脑组织透明化
霍乱毒素亚基-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
四甲基罗丹明葡聚糖	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
荧光尼氏染色剂	Invitrogen	N-21479 (蓝色)	可选
多聚甲醛	Fisher Scientific	SF93
琼脂糖	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
戊巴比妥	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
硼硅酸盐玻璃丝	Harvard Apparatus	G150F-10
拉管仪	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
灌流装置	定制
激光笔	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
滤光片/防护眼镜	Dragon Lasers, China	LSG09 (带通 450-700 nm)
双目解剖显微镜	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	配备高强度照明器 (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
微量注射仪	Parker Instruments	Picospritzer III
安装有 MC Stimulus 软件的计算机	Multi Channel Sys-tems, Germany (软件)
双通道刺激器	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
刺激隔离单元	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
显微操作器	Narishige, Japan	YOU-1
振动切片机	Leica, Germany	VT1000S