肺动脉高压啮齿类动物模型的血流动力学表征

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种累及肺小动脉的疾病，可导致肺小动脉闭塞并引发右心室衰竭。啮齿类动物PAH模型对于理解PAH的病理生理机制至关重要。本文展示了在小鼠和大鼠中通过右心导管术和超声心动图进行血流动力学表征的方法。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种罕见的肺血管疾病，其特征是内皮细胞凋亡、平滑肌细胞增殖以及肺小动脉的闭塞。这继而导致右心室（RV）功能衰竭，并伴有显著的发病率和死亡率。小鼠和大鼠的肺动脉高压动物模型对于理解该罕见疾病的病理生理机制具有重要意义。值得注意的是，不同的肺动脉高压模型可能伴随不同程度的肺动脉高压、右心室肥厚以及右心室功能衰竭。因此，对肺动脉高压小鼠和大鼠进行全面的血流动力学表征，对于评估药物或基因修饰对疾病的影响至关重要。

本文展示了在大鼠和小鼠肺动脉高压（PAH）模型中评估右心室功能及血流动力学的标准操作流程。超声心动图可用于评估大鼠的右心室（RV）功能，但在清醒小鼠中获取标准的右心室切面较为困难。经胸腔内颈静脉入路可实现对闭胸状态下的小鼠和大鼠进行右心导管检查。压力测量可采用连接液体压力传感器的聚乙烯导管或微型压阻式导管。压力-容积环分析可在开胸条件下进行。完成血流动力学测量后，处死实验动物。随后可将心脏解剖，分离右心室游离壁与左心室（LV）及室间隔（S），以便通过Fulton指数（RV/(LV+S)）评估右心室肥厚程度。之后可根据需要采集心脏、肺脏及其他组织样本用于后续分析。

引言

肺动脉高压（PAH）是一种累及肺血管的疾病，其特征为炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖以及内皮细胞凋亡。这些改变导致肺小动脉闭塞，进而引起右心室（RV）功能障碍和心力衰竭。为了深入理解PAH及其右心室衰竭的病理生理机制，研究人员已开发出多种不同的研究模型，包括遗传性和药理学模型（其他文献已有综述^1,2）。

在这些模型中，最常用的是小鼠低氧诱导型肺动脉高压（Hx）模型，以及大鼠的野百合碱（MCT）模型和SU5416-低氧（SuHx）模型。在小鼠Hx模型中，小鼠暴露于4周的低氧环境（常压或减压性低氧，相当于海拔18,000英尺，FiO₂为0.10），导致肺动脉中膜增生、右心室收缩压升高以及右心室肥厚的形成³。单次给予60 mg/kg剂量的MCT可通过尚不明确的机制损伤肺血管内皮细胞，进而引发肺动脉高压⁴。SU5416是一种血管内皮生长因子受体（VEGFR）1和2的抑制剂，单次皮下注射60 mg/kg后，再持续暴露于低氧环境3周，可导致不可逆的肺动脉高压，并出现与人类疾病相似的病理改变，包括闭塞性血管病变的形成⁵。近年来，已开发出多种肺动脉高压的转基因小鼠模型，其中包括骨形态发生蛋白受体2（BMPR2）基因的敲除和突变模型，因为BMPR2基因突变在家族性和特发性肺动脉高压中均有发现，此外还包括血红素加氧酶-1基因敲除和IL-6过表达模型（其他文献已有综述^1....

方案

所有操作步骤均遵循杜克大学医学院的动物护理指南。

1. 实验开始前的准备

注意：在进行任何动物实验操作之前，必须确保已获得相应的机构许可。与所有实验操作一样，应使用适当的镇痛药物，以确保动物不会遭受痛苦。

1. 使用肝素化无菌生理盐水（100 U/ml）冲洗导管，以确保导管通畅。从导管尖端标记出相当于从心脏至颈部中点长度的距离（大鼠约4 cm，小鼠约2 cm）。
2. 对小鼠或大鼠进行麻醉。可选的麻醉剂包括异氟烷（诱导浓度3-4%，维持浓度1.5%，与100%氧气混合使用）、氯胺酮/赛拉嗪（80-120/10 mg/kg）和戊巴比妥钠（40-80 mg/kg）⁶。
   1. 例如，使用氯胺酮:赛拉嗪（小鼠腹腔注射80-120 mg/kg:10-16 mg/kg，大鼠腹腔注射80-100 mg/kg:5-10 mg/kg），单次给药可维持麻醉20-50分钟。进行超声心动图检查时，建议使用异氟烷麻醉小鼠或大鼠（诱导浓度3-4%，维持浓度1.5%）。通过夹捏手术区域的肢体来评估麻醉深度，确认无回缩反射。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
      注意：正确使用并优化不同麻醉剂均可获得可靠结果（其他文献已有综述⁶）。我们进行导管插入术时倾向于使用氯胺酮:赛拉嗪。氯胺酮/赛拉嗪过量可能显著降低心率和心脏功能，因此维持适当的体....

结果

由于啮齿类动物的右心导管检查通常是一种终末性操作，无法用于纵向随访，因此超声心动图是一种出色的非侵入性替代方法，可用于筛查和随访¹²。在人类肺动脉高压（PAH）的超声心动图评估中，肺动脉收缩压通常通过三尖瓣反流来估算，该反流在心尖切面中通常易于获取；然而，在啮齿类动物中，该切面难以稳定获得，因而无法通过多普勒方法估测肺动脉收缩压。但是，啮齿类动物中可在主动脉水平清晰显示胸骨旁短轴（PSAX）切面，从而能够记录并测量肺动脉多普勒频谱曲线，其波形形态已被证实与肺动脉高压的程度相关¹²。超声心动图研究的代表性结果见图3。在本方案中，超声检查操作人员对动物所接受的治疗或操作设盲。结果采用离线分析。

右心导管术及右心室收缩压（RVSP）的测量是肺动脉高压（PAH）在啮齿类动物模型中定量的金标准，当不存在肺动脉狭窄时，RVSP可准确估计肺动脉收缩压^13,14。本方案中介绍了用于右心室压力测量的闭胸法（图5）和用于右心室压力-容积（P-V）环分析的开胸法（

讨论

本文所述方案详细介绍了肺动脉高压啮齿类动物模型中血流动力学和右心室功能的全面表征方法。尽管本文描述的右心导管术为终末性操作，但超声心动图检查相关的死亡率极低，因而可用于疾病进展的筛查和随访。然而，与肺动脉高压（PH）患者在麻醉状态下死亡率显著升高相似¹⁷，根据我们的经验，患有重度PH的大鼠由于右心功能失代偿、右心室前负荷降低，以及继发的低氧性肺血管收缩，对麻醉的耐受性较差。因此，缓慢诱导麻醉并密切监测呼吸功能至关重要。

本视频和插图展示了我们实验室在这些操作中取得成功的方法，尽管也可采用其他替代方案（详见 Pacher 等⁶的综述）。在肺动脉高压（PH）研究中，为了准确表征不同的疾病模型以及遗传或药物干预对这些模型的影响，必须使用这些技术。每种方法均有其固有的局限性：超声心动图对右心室的成像视野有限，且难以进行定量分析；闭胸导管插入术仅能通过右心室收缩压（RVSP）估算肺动脉压力，对右心室功能的评估也仅限于dP/dt；开胸导管插入术则需打开胸腔，可能影响静脉回流和右心功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vevo 2100 成像系统 (120V)	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo 2100 成像工作站	VisualSonics, inc.
高频机械换能器	VisualSonics, inc.	MS250, MS550D, MS400
超声耦合剂 Parker	Laboratories Inc.	01-08
PowerLab 4/35	ADInstruments	ML765
Labchart 8	ADInstruments
带三通阀和电缆的血压换能器	ADInstruments	MLT1199
血压换能器校准套件	ADInstruments	MLA1052
用于小鼠的 Mikro-Tip 压力导管	Millar	SPR-1000	可选自 Scisense FT111B（小鼠）和 FT211B（大鼠）的替代导管
用于大鼠的 Mikro-Tip 压力导管	Millar	SPR-513	可选自 Scisense FT111B（小鼠）和 FT211B（大鼠）的替代导管
Millar Mikro-Tip 超微型小鼠 PV 环导管	Millar	PVR-1035	可选自 Scisense FT112（小鼠）的替代导管
Millar Mikro-Tip 超微型大鼠 PV 环导管	Millar	SPR-869	可选自 Scisense FT112（小鼠）的替代导管
Millar PV 系统 MPVS-300	Millar	MPVS-300
4-0 黑色丝线编织线 100 码卷轴	Roboz Surgical	SUT-15-2
6-0 黑色丝线编织线 100 码卷轴	Roboz Surgical	SUT-14-1
精细虹膜剪刀，Integra Miltex	VWR	21909-248
VWR 解剖剪刀，锐/钝头	VWR	82027-588
VWR 精细剪刀，4 1/2"	VWR	82027-582
双齿止血钳，Excelta	VWR	63042-090
中性缓冲福尔马林	VWR	89370-094
蛇毒酶 Crotaline	Sigma	C2401
SU5416	Tocris Biosciences	3037
3.5X-45X 双筒变倍立体显微镜带支架	AmScope	SM-3BX
PE（聚乙烯管）-10	Braintree Scientific Inc	PE10 36 FT
PE（聚乙烯管）-50	Braintree Scientific Inc	PE50 36 FT
PE（聚乙烯管）-60	Braintree Scientific Inc	PE60 36 FT
台式异氟烷麻醉机	Kent Scientific	ACV-1205S
Surgisuite 多功能手术平台	Kent Scientific	Surgisuite
牵开器套装	Kent Scientific	SURGI-5002
麻醉诱导舱	VetEquip	941443
麻醉气体过滤罐	Kent Scientific	ACV-2001
啮齿动物鼻罩	VetEquip	921431