אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 2. שיטות כלליות
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
עבודה במעבדה הבלימה 4 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL-4) דורש זמן ותשומת לב רבה לפרטים. אותה העבודה אשר נעשתה במעבדת BSL-2 עם פתוגנים הלא גבוהת תוצאה תיקח זמן רב יותר באופן משמעותי באווירת BSL-4. דרישת הזמן גדלה זאת בשל מספר רב של גורמים אשר שמטרתם להגן על החוקר מזיהומים-רכש מעבדה, סביבת העבודה מזיהום פוטנציאל ואת הקהילה המקומית מן השחרור אפשרי של פתוגנים גבוהה מכך. בתוך המעבדה, תנועה מוגבלת עקב צינורות אוויר מצורפים חליפות בטיחות גוף מלא חובה. בנוסף, חיטוי של כל פריט יוסר ארונות בטיחות ביולוגיים Class II (BSCs) נדרש. מומחי מעבדה חייבים להיות מאומנים בפרקטיקות של מעבדת BSL-4 ו חייב להראות בקיאות גבוהה המיומנויות הם מבצעים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר הליכים נאותים וטכניקות כדי להבטיח ב מעבדהiosafety ודיוק ניסיוני באמצעות assay רובד נגיפי תקן כהליך למשל. בפרט, שיטות נכונות לעבוד בבטחה בסביבה BSL-4 בעת ביצוע ניסוי יודגש חזותי. טכניקות אלו כוללות: הקמת BSC Class II עבור ניסויים, ניקיון נאות של BSC Class II כאשר סיימו לעבוד, ניהול פסולת וסילוק בטוח של פסולת הנוצרת בתוך מעבדת BSL-4, והסרת דגימות מומתות מבתוך BSL- מעבדה 4 למעבדה BSL-2.
Introduction
כמו בטיחות של אנשי מעבדת טיפול פתוגנים גבוהה מכך (לא prophylaxes זיהום ולא אפשרויות טיפול קיימות) היא בעל חשיבות עליונה, משרד החוץ האמריקאי לבריאות ולשירותי אנוש קימת הנחיות לבניית מתקן ושיטות עבודה מומלצת לניהול הבטוח העבודה עם פתוגנים ביו למעבדות קליניות מנקודת מבט בטיחות ביולוגית 1. באמצעות חקיקה ותקינה, רבים של פרקטיקות ונהלים הפכו דרישות החובה שיש אחריו לעבודה עם פתוגנים אלה. בארצות הברית, פתוגנים המועברים בקלות מאדם לאדם, לגרום שיעורי מקרה הרוגים גבוה, ו / או יש פוטנציאל ההשפעה על בריאות הציבור הגדולות טרור ביולוגי, מסווגים כמו המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות מחלות (NIH / NIAID) עדיפות א 'פתוגנים או המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) קטגוריה טרור ביולוגי סוכנים 2. בנוסף, hפתוגנים igh-התוצאה מסווגות Tier 1 סוכנים בחרו אם פתוגנים אלה הם סוכני טרור ביולוגיים פוטנציאליים, יש פוטנציאל פגיעה המונית או השפעות הרסניות למשק, תשתיות קריטיות, או אמון ציבור 3.
BSL-4 פעולות, כוללים גישת מכונים עם מעבדות BSL-4, נשלטות מאוד יותר BSL-2/3 פעולות. למשל, הוא משמעותי יותר קשה כדי לקבל גישה למעבדת BSL-4 לעומת מעבדת BSL-2 או BSL-3 עקב דרישות הכשרת חליפה משמעותיות, דרישות חונכות נרחבות, ואת תנאים מוקדמים בטיחות ביולוגית רפואית נוספים. בנוסף, יש בדרך כלל יותר מחסומים אבטחה פיזית במתקן BSL-4 לעומת מתקן BSL-2 או BSL-3 4-6. כפי שמתואר במאמר הראשון שלנו על נהלי כניסת BSL-4 ויציאה, צוות המעבדה לעבור הכשרה מקיפה והקרנה פסיכולוגית להעפיל כניסה למעבדת BSL-4 7. Within במעבדת BSL-4, סיכון לזיהום וטעויות נמנעים או מתן ידי ביצוע נהלים שנקבעו. מחקר חייב להתקדם בזהירות ובכוונה, עם ריבוי משימות או סח דעת מינימאליות. הוא רכן חליפות לחץ חיוביות קשה, ואת מגן הפנים עשוי להגביל הליכים כגון מיקרוסקופיה. כפפות מגושמות לעכב את ביצוע משימות מוטוריקה עדינות, כגון טיפול פריטים קטנים או תיוג צינורות. כדי לצמצם את זמן בילה BSL-4 מעבדות, מומחי מעבדה צריכים לסקור נהלי עבודה לזהות צעדים שניתן לעשות קדימה במעבדת BSL-2 ולאחר מכן להעביר את החומרים הללו לתוך מעבדת BSL-4 עבור השלמת המשימה (ים). כשמוציא חומרים לעיבוד נוסף במעבדת BSL-2, חומרים שתוקנו והוציאו מהמעבדה BSL-4 במכל משני אטומים. דוגמאות של דגימות כי ייתכן שתהיינה הצורך להסירו כוללות: צלחות קבועות או צינורות של חומר נגוע שתנותחנה ידי immunosorbe אנזים צמודNT assay (ELISA), assay immunofluorescence (IFA), או שרשרת פולימראז התגובה (PCR).
בנוסף מגבלות פיסיות יותר שהטילו ציוד מגן אישי הנדרש במעבדות BSL-4 בהשוואה לאלו BSL-2 מעבדות, נהלי איון של פתוגנים גבוהה תוצאת צלחות תרבית תאים וסילוק פסולת מחמירים מאלה הדרושים וירוסים פחות פתוגניים למד במעבדת BSL-2. לכל הפחות, שיטות אלו צריכות לעמוד בדרישת CDC. לדוגמא, צלחות תרבית תאים מזוהמות וחומרים אחרים יכולים להיות מובטלים עם ריאגנטים כימיים, כגון פורמלין ניטראלי שנאגר. מטופלי צלחות או צינורות תרבית תאים יוכנסו לתוך שקיות חותמות חום המכילות פורמלין והוציאו מהמעבדה באמצעות טנק דאנק מלא חיטוי נוזלי. פחי אשפה מלאי פתרונות חיטוי ומרסס חיטוי משמש לקבלת פסולת זמנית שנוצרה במהלך הניסוי ועבור דיסיnfecting כפפות, ניקוי משטחים וכלים ארון בטיחות ביולוגית, בהתאמה. פתרון חיטוי אמוניום הרביעון בריכוז המפורט נחשב את תקן הזהב עבור כל המעבדות בארה"ב BSL-4 (Barr J, תקשורת אישית, 2015). פסולת מוצקה מתוך דלי השפכים autoclaved לחסל פוטנציאל זיהום.
במאמץ חזותי להדגים את זרימת העבודה ואת המגבלות של נהלי BSL-4 בכלל, השתמשנו assay פלאק ויראלי תקן כדוגמא הליך ויראלי נפוץ. בעוד הליך assay ויראלי מתואר באופן כללי, אנו מדגישים את נהלי הבטיחות הביולוגיים בשימוש על מנת להבטיח בטיחות של אנשי מעבדה בפרוטוקול זה. עיין חזותי assay פלאק קלסי קודם עבור רקע נוסף על 8,9 טכניקת assay פלאק.
הנהלים שהוצגו כאן בהתאם למפרטי BMBL שהתוו CDC 1. עם זאת, הפרוטוקולים שהוצגו הםספציפית IRF-פרידריך. יש מתקן BSL-4 כל נהלי עבודה סטנדרטיים שונים (SOPs) ודרכי פעילותן המשפיעים על ביצוע ניסויים בתוך המעבדה BSL-4. הליכים חלופיים לניהול זרם פסולת וביצוע מבחני פלאק עשויים להשתנות בהתאם על הניהול והתפעול של מעבדות אלה. אף על פי כן, הבנה כללית של הקמה של מעבדת חליפה BSL-4 ונהלים לביצוע עבודות עם Class II ארונות בתוך סביבת BSL-4 תסייע למדענים להבין את האילוצים ואת השלכות בטיחות כאשר שוקלים מחקרים של פתוגנים בסיכון גבוהים. מודעות מוגברת של משתפי פעולה מחוץ הקשיים שמסביב עבודה במעבדת BSL-4 יכולה להוביל לציפיות מתואמות וקל יותר בפיתוח אמצעי-נגד רפואי בקהילת המחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה במעבדת BSL-4 דורשת זמן ניכר ותשומת לב לפרטים. כל סוג של עבודה בסביבה זו מחייבת מאומנת היטב, יסודי, ויחידים מצפוניים. את assay רובד נגיפי התקן קובע מודל מדויק של הליך נפוץ לעבודה עם פתוגנים גבוהה תוצאה במעבדה BSL-4, כמו assay כרוך מושגים מרכזיים בהם עובדי מעבדה חייב להיות מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
