人垂体腺瘤细胞的三维海藻酸盐微球培养

摘要

由于三维藻酸盐微球培养方法具有操作简便和可重复性高的优点，因此被选用于维持垂体腺瘤细胞的生长。实验步骤包括首先对肿瘤组织进行酶消化和机械解离，随后将获得的细胞悬液包埋于藻酸盐微球中。

摘要

本文描述了一种三维培养方法，其中将垂体腺瘤原代细胞培养于海藻酸盐微珠中。海藻酸盐是一种来源于褐藻的多聚物。简而言之，将肿瘤组织切成小块后，用胶原酶和胰蛋白酶进行酶消化处理，随后获得细胞悬液。将肿瘤细胞悬液与1.2%的海藻酸钠混合，滴入CaCl₂溶液中，海藻酸盐/细胞悬液在接触CaCl₂后即刻凝胶化，形成球形微珠。嵌入海藻酸盐微珠中的细胞通过添加20%胎牛血清（FBS）的培养基获得营养供给。在海藻酸盐微珠中的三维培养可长期维持腺瘤细胞的活力，最长可达四个月。此外，可通过柠檬酸钠溶液洗涤微珠，将细胞从海藻酸盐中释放出来，并接种于玻璃盖玻片上，以进行后续的免疫细胞化学分析。利用该细胞培养模型，可实现肌动蛋白细胞骨架的固定与可视化，且其结构紊乱程度最小。综上所述，海藻酸盐微珠为垂体腺瘤细胞的维持提供了一种可靠的培养体系。

引言

三维支架已广泛应用于细胞培养，因为它们为培养的细胞提供了三维结构支持，并维持了细胞间的相互通讯¹。来源于天然的聚合物材料已被用于制备三维支架，包括I型胶原蛋白、壳聚糖和海藻酸盐。海藻酸盐是一种从褐藻Macrocystis pyrifera（巨藻）中提取的天然聚合物。该聚合物由重复的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）单元组成²，在某些二价阳离子（如钙离子和钡离子）存在下可形成稳定的凝胶。氯化钙（CaCl₂）溶液通常被用作交联试剂以形成海藻酸盐微球。将海藻酸盐溶液滴入CaCl₂溶液中后，会立即形成三维球形凝胶。当海藻酸盐溶液与细胞混合后，细胞即被包埋于海藻酸盐微球中³。

海藻酸盐具有多种特性，使其可作为包封多种细胞的基质，包括软骨细胞⁴、骨骼肌成肌细胞⁵和神经干细胞⁶。它是一种惰性材料，允许营养物质、氧气和代谢产物扩散，从而维持细胞的存活与功能；此外，与其他基于凝胶的培养系统不同，包埋在海藻酸盐微球中的细胞还可通过钙螯合剂（如柠檬酸钠）从支架中释放出来，进而收获细胞用于后续研究⁷。

垂体腺瘤通常是良性肿瘤，增殖率较低。大鼠垂体腺瘤细胞系已成功在二维培养系统中进行培养⁸。然而，....

方案

本研究使用人体材料的部分已获得当地医学机构伦理委员会以及国家理工学院研究中心与高等研究院伦理委员会的批准。

1. 肿瘤样本获取

1. 通过经蝶窦手术从患者体内获取垂体腺瘤组织活检样本¹⁴。
2. 收集垂体腺瘤样本，并将其放入含有50 ml新鲜199培养基（M199）的无菌玻璃瓶中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、0.6 mg/ml碳酸氢钠、2.4 mg/ml HEPES和1%抗生素（青霉素/链霉素），pH值为7.4。将样本置于装有冰的玻璃瓶中保存。
   注意：肿瘤组织可在手术后数小时内进行处理。
3. 将肿瘤样本置于冰上的玻璃瓶中运送至实验室。

2. 酶解组织解离溶液、胰蛋白酶抑制剂溶液和海藻酸盐溶液的制备

注意：在进行细胞培养操作前，请预先配制以下溶液。使用前，所有溶液均需用 0.22 µm 滤膜过滤。

1. 通过将 5 mg 胶原酶（I 型）溶解于 5 ml 无血清 M199 培养基中，制备 1% 胶原酶溶液。
2. 通过将 0.01 g 胰蛋白酶溶解于 10 ml 含 0.3% EDTA 的 PBS 溶液中，制备 0.01% 胰蛋白酶溶液。
3. 通过将 2 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂溶解于 20 ml 无血清 M199....

结果

该方案已成功应用于腺瘤性垂体细胞在海藻酸盐微球中的培养与长期维持。 图1 显示了培养三个月后包埋于海藻酸盐微球中的细胞；在倒置光学显微镜下，这些细胞呈现双折射的圆形结构（图1）。 图2 显示了包埋于海藻酸盐中的大鼠垂体腺瘤细胞中 N-钙黏蛋白的定位。N-钙黏蛋白定位于细胞间连接处（图2A 和 2C），细胞核则显示染色质呈伸展状态（图2B 和 2C）。

藻酸盐微珠中的肿瘤细胞在培养中可保持活性长达4个月；因此，可在不同时间点从藻酸盐微珠中释放细胞，从而允许对同一细胞培养物中的细胞生物学不同方面进行分析。例如，通过检测Ki-67的免疫反应性，测得10例无功能性人垂体腺瘤的增殖指数，平均标记指数为19.2 ± 1.5%（均值.......

讨论

该方案包含若干关键步骤。首先是微珠尺寸的均一性，这是保持所有细胞培养中营养物质和气体扩散条件一致所必需的。根据我们的经验，使用21 G针头制备海藻酸盐微珠，可有效获得尺寸均一的微珠培养物。第二个重要因素是针头与液面之间的距离；该距离不得超过5 cm，以避免海藻酸盐/细胞溶液流冲击氯化钙溶液液面时造成微珠变形和细胞死亡。第三个关键步骤是玻璃棒搅拌，将微珠滴入搅拌中的溶液以防止其相互粘连。粘连会导致细胞包封不均。

根据具体的研究问题，可对本实验方案进行一些修改。例如，根据我们的经验，可将海藻酸钠溶液与基底膜蛋白（如 IV 型胶原）混合，然后按照前述方案操作，制备出三维海藻酸盐支架。另一种可能性是在直径为 15 mm 的孔中制备悬浮的海藻酸盐凝胶垫；细胞可接种于这些凝胶的表面或内部。当使用海藻酸盐进行实验时，若需要调整 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的浓度，则可能需要进行故障排查，因为水凝胶的稳定性可能因此受到影响。值得注意的是，Ba²⁺ 和 Cu²⁺ 交联的海藻酸盐凝胶在水溶液中相对稳定，但遗憾的是，这些.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
199 培养基	Invitrogen	31100-027	用于细胞培养，使用前在 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	PAA	A15-751
碳酸氢钠 (NaHCO3)	Merck	106329
N-(2-羟乙基)哌嗪-N´-2-乙磺酸 (HEPES)	Sigma	H-4034
青霉素/链霉素	PAA	P11-010
PBS（杜氏磷酸盐缓冲液）	Invitrogen	21600-044
I 型胶原酶	Worthington	4176
胰蛋白酶	Invitrogen	27250-018
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Research Organics	3002E
大豆胰蛋白酶抑制剂	Invitrogen	17075-029
脱氧核糖核酸酶 (DNAse)	Worthington	2139
海藻酸，来源于巨藻 (Macrocystis Pyrifera)	Sigma	A-2158
氯化钙 (CaCl2)	J.T. Baker	1332
柠檬酸钠 (Na3C6H5O7)	J.T. Baker	3646
哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸) (PIPES)	Research Organics	9624P
聚乙二醇 6000 (PEG 6000)	Calbiochem	528877
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 (EGTA)	Research Organics	9574E
硫酸镁 (MgSO4)	J.T. Baker	2500
吐温-100 (Triton-X 100)	Sigma	X100
甲醛	J.T. Baker	2106
多聚甲醛	Sigma	P6148
氯化铵 (NH4Cl)	J.T. Baker	660
牛血清白蛋白 (BSA)，免疫球蛋白 G 缺失型	Jackson Immuno Research	001-000-161
鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯 (Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate)	Sigma	P1951	有毒。操作时需戴手套
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)	Invitrogen	D1306	有毒。操作时需戴手套
硫酸 (H2SO4)	J.T. Baker	9681	强腐蚀性。操作时需戴手套
氢氧化钠 (NaOH)	Merck	1.06498	可能引起眼睛和皮肤刺激。操作时需戴手套
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTS)	Sigma	A-3648
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7280
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
名称	公司	目录编号	备注
设备			有毒：可能致癌。操作时需戴手套
旋转混合仪	Boekel Scientific	型号 230300
离心机	DuPont Corporation	型号 Sorvall TC6
摇床	Lab-line Instruments	型号 314-820