我们提出了一种利用大分子拥挤剂（MMC）获取富含细胞外基质蛋白的细胞衍生基质的实验方案。此外，我们还介绍了一种将MMC应用于三维类器官皮肤共培养体系构建的方案，该方法可在维持构建物成熟度的同时缩短培养时间。
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摘要
摘要
胶原蛋白家族是一类糖蛋白，代表了人体内主要的结构蛋白，也是现代组织工程中所用生物材料的关键组分。目前面临的技术瓶颈是胶原蛋白的沉积问题 体外，因为其速度极慢，导致结缔组织形成不充分以及组织凝聚力较差，尤其是在皮肤模型中。本文介绍一种方法，通过向皮肤培养物中添加不同大小的蔗糖共聚物以产生大分子拥挤效应（MMC），从而显著增强胶原蛋白的沉积。特别是在MMC条件下，与对照组相比，真皮成纤维细胞沉积了大量I型、IV型、VII型胶原蛋白以及纤维连接蛋白。
该方案还描述了一种去细胞化密集细胞层的方法，通过免疫细胞化学证实，大量细胞外基质（ECM）保留在培养表面。利用干涉反射显微镜研究了基质的总质量及其分布模式。有趣的是，成纤维细胞、角质形成细胞以及共培养体系所产生的细胞来源基质（CDM）在组成和形态上各不相同。这些CDM可作为二次细胞接种的"生物支架"，从而避免目前常用的来源于异种动物的涂层或支架材料，推动其向更具临床相关性的应用方向发展。
此外，本方案描述了在三维类器官皮肤共培养模型的浸没阶段应用MMC，该处理足以增强真皮-表皮连接处（DEJ）的细胞外基质沉积，特别是作为锚定纤维主要成分的胶原蛋白VII。透射电子显微镜证实，与对照组相比，添加MMC培养的组织中存在锚定纤维。这一发现具有重要意义，因为锚定纤维可将真皮与表皮连接在一起，因此，预先形成成熟的DEJ可能有助于提高皮肤移植受体的移植物稳定性和整体伤口愈合效果。此外，使用MMC可将培养时间从5周缩短至3周即可获得成熟的皮肤结构，从而降低了成本。
引言
皮肤通过防止水分流失和病原体侵入形成保护屏障。皮肤主要由三个部分组成：富含基质的真皮1、位于其上方的复层表皮2,3,4，以及两者之间的真皮-表皮连接区5,6。真皮主要由胶原纤维和弹性纤维构成，其中分布稀疏的成纤维细胞7。相比之下，细胞丰富的表皮由多层角质形成细胞组成。最内层的角质形成细胞具有增殖能力，可提供新的基底细胞，以更新并替代终末分化的角质形成细胞；这些终末分化的细胞持续向外迁移至皮肤最外层，失去细胞核和细胞质成分，最终形成经历脱屑的角化层。
真皮-表皮连接是一种特殊类型的基底膜，由相互连接的基质分子构成，将表皮锚定于真皮。真皮中的Ⅰ型胶原纤维与富含Ⅳ型胶原的致密板相连的Ⅶ型胶原锚定原纤维交织在一起。锚定原纤维（层粘连蛋白5、ⅩⅦ型胶原和整合素）进一步将致密板与基底角质形成细胞的半桥粒相连接。基底角质形成细胞（基底层）具有增殖更新的能力，也可分化并分层形成上基底层，包括棘层、颗粒层，最终形成角质层，后者构成皮肤与外界环境的接触面。 途中 从基底层到角质层，角质形成细胞会转换细胞角蛋白的表达模式，最终经历凋亡，并通过转谷氨酰胺酶的催化作用，将特定蛋白质共价交联形成角化包膜，将自身包裹其中。
重建皮肤及其各层结构 体外，包括真皮-表皮连接处和真皮细胞外基质的复杂结构，以及模拟角化过程，长期以来一直....
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方案
1. 二维皮肤细胞培养中的大分子拥挤效应
- 在24孔板的每个孔中接种50,000个细胞（原代成纤维细胞、原代角质形成细胞，或原代成纤维细胞与角质形成细胞的共培养体系）。每孔加入1 ml对应细胞类型的生长培养基进行接种。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜，使其贴壁。
- 弃去旧培养基，更换为含大分子拥挤剂和100 µM抗坏血酸的新鲜培养基1 ml。拥挤剂混合物包含37.5 mg/ml Ficoll 70和25 mg/ml Ficoll 400。成纤维细胞培养基（FM）使用DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素。角质形成细胞培养于无血清培养基KSFM或CnT-57中。共培养体系则使用50% FM与50%无血清培养基的混合液进行维持。
- 将培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育6天，每隔2天更换一次培养基。
2. 皮肤细胞培养物的荧光免疫染色
- 用 1× PBS 将细胞培养物洗涤两次。
- 根据抗体说明书，使用甲醇或甲醛固定细胞培养物。
- 甲醇固定
- 向每个孔中加入 500 µl 冷甲醇，在 -20 °C 下孵育 10 分钟。吸除固定液并丢弃甲醇废液。在超净工作台中风干。
....
- 甲醇固定
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结果
大分子拥挤效应能够增强细胞外基质（ECM）的沉积，特别是与对照组培养物相比，成纤维细胞沉积了更多的I型胶原、IV型胶原和纤连蛋白（图1，细胞层；1A，I型胶原；1B，IV型胶原；1C，纤连蛋白）。在去细胞化后，明显可见与角质形成细胞相比，成纤维细胞是I型胶原、IV型胶原和纤连蛋白的主要沉积细胞（图1，基质）。
在 图2观察到成纤维细胞而非角质形成细胞是VII型胶原的主要产生细胞。这是首次成功沉积VII型胶原的报道 体外 （贝尼 等, 2015).
通过使用特异性抗体进行免疫荧光染色来表征细胞来源的.......
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讨论
通过向细胞培养体系中添加大分子拥挤剂，可利用排阻体积效应促进蛋白酶对前肽的切割，从而获得增强的细胞外基质。这使得细胞外基质（尤其是胶原蛋白）的加工速度加快，并更高效地沉积于培养表面。尽管其他研究团队也曾获得较厚的成纤维细胞层，但所需培养时间长达数周20。相比之下，本实验方案中描述的MMC（大分子拥挤）技术显著缩短了培养时间，同时增加了细胞外基质的产量。在拥挤的细胞培养环境中反应速率的提升，也已在软骨细胞基质沉积21、细胞外基质组装22,23以及脂肪生成过程24中得到报道。
在去除致密细胞层的细胞成分后，收集细胞来源的基质并用于多种组织工程应用，其中之一是在细胞来源的基质上接种次级细胞培养物25,26。由于这些基质是细胞来源的天然产物，若在非理想条件下长期保存，可能发生降解。在MMC条件下获得的细胞来源基质的一个显著优势在于其具有细胞来源性和细胞特异性。这可能成为商业涂层的一种潜在替代方案，后者通常价格昂贵且来源于动物。皮肤等效物必须小心处理，尤其是在固定之前。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由新加坡生物医学研究理事会通过向医学生物学研究所提供的核心支持及基金 SPF2013/005 资助。M.R. 获得新加坡国立大学教员研究委员会基金（医学工程）（M.R.）R-397-000-081-112 以及新加坡国立大学组织工程计划（NUSTEP）的支持。作者谨此感谢 Irene Leigh 教授提供 VII 型胶原抗体。电子显微镜工作在新加坡国立大学电子显微镜单元完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗坏血酸 | 和光 | 013-12061 | 细胞培养基添加剂 |
| 细胞培养小室 （6孔板规格） | Greiner Bio-One | 657610 | 器官型培养 |
| 柠檬酸盐溶液 | Dako | S2369 | DakoCytomation 抗原修复液 柠檬酸盐，pH 6 (10倍浓缩液) |
| 胶原蛋白（大鼠尾部） | 康宁 | 354236 | 器官型培养 |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | 细胞培养基 |
| DAB底物+显色剂试剂盒 | Dako | K3468 | 组织学 |
| 深孔板（6孔格式） | 康宁 | 355467 | 器官型培养 |
| ECL 检测试剂 | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL 蛋白质印迹检测试剂 |
| 透射电子显微镜（TEM） | JEOL | JEM-1010（100 kV） | 透射电子显微镜技术 |
| 成纤维细胞培养基（FM） | 高糖DMEM + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素 | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | 大分子拥挤剂 |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | 大分子拥挤剂 |
| 无血清角质形成细胞培养基（KSFM） | Life Technologies | 17005-042 | 细胞培养基 |
| 裂解缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 89900 | 用于蛋白质提取的裂解缓冲液。向该裂解缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂（Roche，#11836170001）。 |
| 显微镜 | Zeiss | LSM510 | 红色、绿色和蓝色通道分别用于显示 AF594、AF488 和 DAPI 荧光免疫染色（40倍放大）。 |
| 封片剂（Hydromount） | 国家诊断公司 | HS-106 | 荧光染色 |
| 封片剂（Cytoseal） | 赛默飞世尔科技 | 8310-16 | 组织学（HRP） |
| OCT 包埋剂（Tissue Tek） | 樱花 | 4583 | 冷冻切片包埋 |
| 青霉素-链霉素抗生素 | Sigma Aldrich | A5955 | 细胞培养基添加剂 |
| <强>一抗 | |||
| 抗胶原蛋白I抗体 | Abcam | #ab6308 | |
| 抗IV型胶原蛋白 | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| 抗胶原蛋白VII | LH7.2（实验室自制品） | ||
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | #ab2413 | |
| 还原剂 | 赛默飞世尔科技 | NP0009 | 蛋白质印迹 |
| 上样缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | NP0008 | 蛋白质印迹法 |
| <强>二抗（免疫染色） | |||
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 山羊抗兔 | 赛默飞世尔科技 | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 山羊抗小鼠 | 赛默飞世尔科技 | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 鸡抗兔 | 赛默飞世尔科技 | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 山羊抗小鼠 | 赛默飞世尔科技 | #A-11001 | |
| 二抗（HRP） | Dako | Envision + 系统 - HRP 标记的聚合物抗兔和抗鼠 | 未稀释的 |
| 脱氧胆酸钠 | 化工与食品 | 脱细胞化 | |
| <强>分层介质 | |||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 火腿’s F12 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 10% 胎牛血清 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 链霉素 | 用于类器官培养的气-液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 0.4 mg/ml 氢化可的松 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 5 mg/ml 胰岛素 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 1.8·10-4 M 腺嘌呤 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 5 mg/ml 转铁蛋白 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 2·10⁻¹¹ M 三碘甲状腺原氨酸 | 用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。 | ||
| 胰蛋白酶 | 生物园共享设施 | 0.125% 胰蛋白酶/Versene pH 7.0 + 0.3 | 用于消化细胞 |
参考文献
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....
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重印与许可
