结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
在神经发育过程中，生长中的轴突通过形成轴突分支延伸至多个突触靶点。轴突分支的形成受到细胞外导向信号分子（如netrin-1）的促进，并导致轴突质膜表面积显著增加。netrin-1依赖的轴突分支可能涉及对质膜扩展在时间和空间上的精确调控，而质膜组分则通过胞吐囊泡的融合得以补充。这些融合事件之前通常会发生SNARE复合物的形成，该复合物由囊泡SNARE蛋白（如VAMP2，即囊泡相关膜蛋白2）以及质膜上的靶SNARE蛋白syntaxin-1和SNAP25（突触小体相关蛋白25）共同组成。本文详细描述了一种多角度的研究方法，用于探究SNARE介导的胞吐作用在轴突分支中的功能。该联合方法的优势在于能够在不同的时空分辨率下获取数据，范围涵盖单个神经元中单个囊泡融合事件的动力学，到培养神经元群体中SNARE复合物的形成及轴突分支的整体分析。本实验方案结合了成熟的生物化学方法，用于检测内源性SNARE复合物的水平，同时利用表达pH敏感型GFP标记VAMP2（VAMP2-pHlourin）的皮层神经元进行全内反射荧光（TIRF）显微成像，以识别单个神经元中netrin-1依赖的胞吐活性变化。为了阐明netrin-1依赖性分支发生的时间进程，采用延时微分干涉差（DIC）显微成像技术对单个神经元进行数小时尺度的动态观察。通过固定细胞免疫荧光染色，并结合可切割SNARE蛋白机器并阻断胞吐作用的肉毒神经毒素处理，结果表明netrin-1依赖的轴突分支需要SNARE介导的胞吐活性参与。
引言
最近的估计表明，人脑包含约1011个神经元和1014个突触连接1，凸显了体内轴突分支的重要性。体外轴突导向信号分子（如netrin-1）可引导轴突到达合适的突触伙伴，并促进轴突分支，从而增加突触容量2-5。netrin-1依赖的轴突分支过程涉及大量质膜的扩展6，我们推测这一过程需要通过SNARE复合物介导的胞吐囊泡融合来递送额外的膜组分7。
研究SNARE介导的胞吐作用在netrin-1依赖性轴突分支中的功能受到多种因素的制约。首先，皮层神经元的异质性增加了识别显著效应所需的样本量，使成像等单细胞技术的应用变得复杂。其次，尽管生化技术能够观察到群体水平上的变化，但其在时间和空间分辨率上的局限性，使其难以在轴突分支发生的时间窗口内将质膜扩展精确定位于轴突。最后，尽管轴突分支的形成需要数小时，但参与轴突延伸的细胞变化可能在数分钟内启动，并在数秒量级的时间尺度上发生，从而进一步扩大了实验所需考虑的时间范围。
我们概述了一种多技术联合的方法，该方法能够应对胞吐作用和轴突分支在时间和空间尺度上的多样性，从而加深了我们对基本细胞机制的理解。采用这些方法提供了证据，支持SNARE介导的胞吐作用在轴突分支中具有关键作用。
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方案
研究伦理声明：本文所述所有涉及动物的实验均须遵守北卡罗来纳大学动物护理委员会（UNC Committee on Animal Care）的规定以及美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的标准。
1. 解离皮层神经元的制备与接种
- 通过吸入 CO2 并随后进行颈椎脱位，处死孕鼠。取出胚胎第 15.5 天（E15.5）小鼠的全脑，并从每个半球显微解剖分离出皮层。有关小鼠胚胎皮层显微解剖的详细操作步骤，请参见 Viesselmann et al8。
- 将不超过 4 个皮层组织置于无菌 1.6 ml 微管中，加入 1 ml 解剖液。加入 120 μl 的 10 倍浓度胰蛋白酶，轻轻颠倒混匀 3–5 次。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以接种细胞培养皿。注意：一个皮层半球大约可提供三百万个细胞。
- 对于 SDS 抗性 SNARE 复合物生化检测实验，每 35 mm 培养皿接种六百万个细胞，每种实验条件使用两个培养皿。注意：当比较多个实验条件时，使用 6 孔板可简化操作。
- 对于分支形态分析实验，将神经元接种在经硝酸清洗的圆形盖玻片上，接种密度为每 35 mm 培养皿 250,000 个细胞；若用于微分干涉差（DIC）成像观察轴突分支，则接种密度为每 35 mm 培养皿....
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结果
利用 体外 用于检测神经元群体中SDS抗性SNARE复合物含量的生化技术 图1 显示SDS抗性SNARE复合物检测完成后，针对SNAP-25、syntaxin1A和VAMP2探查所得的Western印迹结果。
在细胞基底膜上进行全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，可对单个细胞中单个胞吐融合事件提供高分辨率图像。图2A展示了用于识别由VAMP2-phluorin介导的胞吐事件的图像分析方法。插图显示了囊泡融合发生时，VAMP2-phluorin在质膜内扩散的单个胞吐事件。图2B展示了一个皮层神经元中随时间（秒）发生的胞吐事件示例。放大插图标示了胞体、轴突分支以及轴突生长锥，体现了该检测方法的空间应用价值。圆形标记代表可通过TIRF显微镜观察到的单个胞吐融合事件。
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讨论
轴突分支是一种基本的神经发育过程，是哺乳动物神经系统广泛神经连接的基础。理解局部质膜扩张所涉及的机制，对于我们认识正常和病理状态下的神经发育均至关重要。采用结合群体水平与单细胞水平方法的多角度研究策略，可在不牺牲群体水平分析的前提下，提高实验的可重复性，并增强空间和时间分辨率。在单细胞水平上，结合固定细胞和活细胞技术来研究netrin依赖性的轴突分支具有三重优势：能够在多个实验中收集到较大的样本量，通过微分干涉差（DIC）成像实现时间分辨率，以及利用全内反射荧光（TIRF）显微镜实现对外排融合事件的时空分辨率观察。
SDS抗性SNARE复合物检测法可用于测量培养皮层神经元中SNARE活性，同时考虑了神经元群体的异质性。SNARE复合物极为稳定，大多数其他蛋白质复合物在加入SDS后会解离，而SNARE复合物则具有SDS抗性，但不耐高温。这一特性使得定量检测SNARE复合物及SNARE单体的含量成为可能。由于需要在不同丙烯酰胺浓度下进行多次SDS-PAGE凝胶电泳，因此接种细胞时密度应不少于每孔600万个，以获得足够的蛋白量，这一点至关重要。该方法仅需常规实验室试剂、具备进行Weste.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助：RO1-GM108970（SLG）和 F31-NS087837（CW）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔组织培养处理板 | Olympus Plastics | 25-105 | |
| 玻璃盖玻片 | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5；必须用硝酸处理24小时，用去离子水冲洗两次，并在使用前干燥。使用前必须用1 mg/ml多聚赖氨酸（Poly-d-lysine）包被并冲洗。 |
| Amaxa核转染溶液 | Lonza | VPG-1001 | 每转染100 ml |
| Amaxa Nucleofector/电穿孔仪 | Lonza | 程序O-005 | |
| 35 mm玻璃底活细胞成像培养皿 | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | 必须用1 mg/ml多聚赖氨酸（Poly-d-lysine）包被并在接种细胞前冲洗 |
| Olympus IX81-ZDC2倒置显微镜 | Olympus | ||
| Lambda LS氙灯 | Sutter Instruments Company | ||
| 环境控制载物台培养箱 | Tokai Hit | ||
| 100倍 1.49 NA TIRF物镜 | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD相机 | Andor | ||
| Odyssey Licor红外成像系统 | LI-COR | Odyssey CL-X | 用于印迹扫描 |
| Image Studio软件套件 | LI-COR | 用于Odyssey红外系统的扫描；Image Studio Lite用于印迹的离线分析 | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | 版本 7.7.6.0 | 用于所有成像及DIC延时图像分析的软件 |
| CELL TIRF控制软件 | Olympus | 用于控制TIRF成像激光的软件 | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ 版本 1.49t | |
| 60倍 Plan Apochromat 1.4 NA物镜 | Olympus | ||
| 40倍 1.4 NA Plan Apochromat物镜 | Olympus | ||
| Neurobasal培养基 | GIBCO | 21103-049 | 无血清培养基和胰酶中和培养基的基础溶液 |
| B27补充剂 | GIBCO | 17504-044 | 每500 ml培养基中加入50 ml，用于无血清培养基和胰酶中和培养基 |
| L-谷氨酰胺 | 35050-061 | 每50 ml无血清培养基中加入1 ml | |
| 牛血清白蛋白 | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10%溶液（溶于1x PBS）用于盖玻片封闭；5%溶液（溶于TBS-T）用于硝酸纤维素膜封闭。 |
| 10x 胰酶 | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| 含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Corning | 21-030-cm | |
| 胎牛血清 | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| 汉克氏平衡盐溶液（HBSS） | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS碱 | Fisher scientific | BP152-5 | |
| 没食子酸丙酯 | MP Biomedicals | 102747 | |
| 甘油（光度级） | Acros Organics | 18469-5000 | |
| 甘油（非光学级） | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| β-巯基乙醇 | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| 蒸馏水 | GIBCO | 152340-147 | |
| 多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine） | Sigma | p-7886 | 溶于无菌水，配制成1 mg/ml溶液 |
| 肉毒杆菌毒素A（BoNTA） | List Biological Laboratories | 128-A | |
| 兔多克隆抗人VAMP2抗体 | Cell signaling | 11829 | |
| 鼠单克隆抗大鼠Syntaxin1A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| 山羊多克隆抗人SNAP-25抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| 鼠单克隆抗人βIII-微管蛋白抗体 | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 488鬼笔环肽，或Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR红外染料二抗 | LI-COR | P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800标记驴抗小鼠，680标记驴抗兔，680标记驴抗山羊 |
| 孔径0.2 μm的硝酸纤维素膜 | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| 甲醇 | Fisher scientific | S25426A | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B5525-5G | |
| 蔗糖 | Fisher scientific | S6-212 | |
| 多聚甲醛 | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| 曲拉通X-100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液 | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 经验证的替代抗体 | |||
| 鼠单克隆抗Syntaxin HPC-1克隆抗体 | Sigma Aldrich | S0664 | |
| 鼠单克隆Synaptobrevin 2 (VAMP2)抗体 | Synaptic Systems | 104-211 | |
| 鼠单克隆SNAP25抗体 | Synaptic Systems | 111-011 |
参考文献
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Métin, C., Deléglise, D., Se....
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