Een vereenvoudigde methode voor de Ultra-Low Density, Long-Term Primaire hippocampus Neuron Cultuur
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
Het kweken van primaire hippocampus neuronen in vitro vergemakkelijkt mechanistische ondervraging van de vele aspecten van neuronale ontwikkeling. Gedissocieerde embryonale hippocampale neuronen groeien vaak succesvol op dekglaasjes met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden, maar lage dichtheid kweken vereisen typisch een toevoer van trofische factoren door co-kweken ze met een glia voedsterlaag, bereiding kan tijdrovend zijn en moeizaam. Bovendien kan de aanwezigheid van glia interpretatie van de resultaten en te vermijden studies op neuron-specifieke mechanismen verwarren. Hier wordt een vereenvoudigde werkwijze voorgesteld voor ultralage dichtheid (~ 2000 neuronen / cm 2), lange termijn (> 3 maanden) primaire hippocampale neuron cultuur die onder serumvrije omstandigheden en zonder glia Celdrager. Lage dichtheid neuronen gekweekt op poly-D-lysine beklede dekglaasjes en knipte hoge dichtheid neuronen gekweekt in een 24-wells plaat. In plaats van paraffine punten om een ruimte te creëren between de twee neuronale lagen, kunnen de onderzoekers eenvoudig etsen plastic bodem van de put, waarop de hoge dichtheid neuronen bevinden, een microspace tot een lage dichtheid neuron groei. De co-kweek kan gemakkelijk worden gehandhaafd gedurende> 3 maanden zonder aanzienlijk verlies van lage dichtheid neuronen, waardoor de morfologische en fysiologische studie van deze neuronen vergemakkelijken. Om deze succesvolle cultuur aandoening te illustreren, worden de gegevens verstrekt aan overvloedig synapsvorming in lage dichtheid cellen na langdurige cultuur te laten zien. Deze co-cultuur systeem vergemakkelijkt ook het voortbestaan van schaarse individuele neuronen gekweekt in eilanden van poly-D-lysine substraten en dus de vorming van autaptic verbindingen.
Introduction
Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping 1 onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (> 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie 2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, maakt deze werkwijze het observeren, zoals live imaging of immunocytochemie (ICC) kleuring via één brandvlak 3; of manipulaties, zoals de behandeling met geneesmiddelen en transfecties 3-6. Wanneer ze groeien bij hoge dichtheid, neuronen hebben de neiging om hoge tarieven van de overleving als gevolg van hogere co hebbenncentrations uitgescheiden groeifactoren naast voedings steun van de groeimedia, en vanwege neuriet contact-afhankelijke mechanismen 7. Echter, een lage dichtheid hippocampus neuronen zijn wenselijk voor morfologische studies, waarbij een individueel neuron in zijn geheel kan worden afgebeeld of gekleurd voor ICC-analyse. Lage dichtheid neuronen zijn moeilijk te handhaven in kweek door gebrek aan ondersteuning paracriene en dus vereisen vaak trofische ondersteuning van een gliale (typisch corticale astrocyten) voedsterlaag, die moet worden opgemaakt voor neuron cultuur 2. Als co-gekweekt met een gliale cel voedsterlaag worden lage dichtheid neuronen gekweekt op dekglaasjes en vervolgens omgedraaid bovenop de glia laag, zodat het lage dichtheid neuronen en glia tegenover elkaar. Een kleine afgesloten ruimte tussen glia en neuronen wordt gecreëerd door het plaatsen van paraffine stippen op de hoeken van de dekglaasjes derhalve tot een 'sandwich' layout 2,8,9. De lage dichtheid neuronen zal groeien wedurende de beperkte ruimte tussen glia en het dekglaasje, die een tolerante micro-omgeving met geconcentreerde factoren uitgescheiden door neuronen en glia creëert. Deze aanpak levert een lage dichtheid, volledig ontwikkeld neuronen die redelijk uit elkaar geplaatst zijn, dus het vergemakkelijken van etikettering ICC of live-imaging studies.
Een duidelijk nadeel van neuron-glia co-cultuur, afgezien van tijdrovend en moeizaam, is dat het voorkomt onderzoek neuron-specifieke of cel-autonome mechanismen. Hoewel dit systeem is veel minder complex dan in vivo zenuwweefsel, glia effect op neuron ontwikkeling door middel van uitgescheiden, nog-niet-helemaal-gedefinieerde factoren kunnen de experimenten 10 beschamen. Daarom is in experimenten die het onderzoek naar neuron specifieke mechanismen, gedefinieerd kweekomstandigheden die te verwijderen serum en gliacellen steunlaag nodig zijn nodig. Een eerdere studie heeft kunnen kweken lage concentraties van neuronen (~ 9000 cellen / cm2) met een eree dimensionale hydrogel matrix 11. Omdat een relatief zuivere neuronale populatie kan worden gekweekt met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden zonder glial steun Onze hypothese is dat ultra-lage dichtheid van hippocampale neuronen in serumvrij gedefinieerd kweekmedium worden gekweekt door co-kweken ze met hoge dichtheid neuronen, in een manier die analoog is aan de conventioneel aangenomen neuron-glia co-cultuur. Inderdaad, hoge dichtheid hippocampale neuron culturen in een "sandwich" configuratie zijn onlangs gebruikt om een klein aantal gespecialiseerde endocriene magnocellulaire neuronen 12 ondersteunen.
Daarom kan co-kweek met hoge dichtheid neuronen mogelijk lage dichtheid neuronen trofische factoren ondersteuning die voldoende is om de overleving op lange termijn mogelijk ontvangen. Dit protocol van het kweken van ultra-lage dichtheid neuronen werd dus geformuleerd en gevalideerd. Het protocol kan worden uitgevoerd binnen een enkel experiment, door het bereiden van een hoge dichtheid (~ 250.000 cellen / ml) dispelde hippocampale neuronen, en dan het maken van een verdunning tot een dichtheid ~ 10.000 neuronen op / ml (~ 3000 neuronen / dekglaasje of ~ 2000 neuronen / cm 2), die veel lager dan de meeste gerapporteerde lage dichtheid cultures 2,3,9 , 11,13. Dit kweekomstandigheid is losjes aangeduid als "ultra-low density cultuur en worden met" lage dichtheid "onderling verwisselbaar. De hoge dichtheid neuronen uitgeplaat op poly-D-lysine beklede 24-putjesplaten; terwijl de lage dichtheid neuronen gezaaid op poly-D-lysine beklede 12-mm dekglaasjes die in een andere 24-wells plaat geplaatst. De dekglaasjes met hechtende lage dichtheid neuronen worden omgedraaid op de top van de hoge dichtheid neuronen 2 uur later nadat de neuronen zijn afgedaald en aan de dekglaasjes. Bovendien, in plaats van paraffinewas stippen op de dekglaasjes boven de hoge dichtheid laag neuron verhogen, werd een 18 G naald gebruikt om de bodem van de 24 well platen etsen met twee evenwijdige strepen. De resulterende DISPLAced, grenzend aan plastics zorgen voor een verhoogde steun voor de dekglaasjes. Deze ruimte wordt consequent gemeten bij 150-200 urn, die voldoende zuurstof en kweekmedium uitwisseling mogelijk maakt, terwijl een micro-omgeving met geconcentreerd trofische factoren. Onder deze voorwaarde, de lage dichtheid neuronen groeien op grote schaal, en kan overleven dan drie maanden in de cultuur. Wanneer deze neuronen worden getransfecteerd met GFP plasmide na drie weken in cultuur worden de dendrieten rijkelijk bezaaid met dendritische stekels. Als bewijs van principe worden gegevens die aantonen dat deze co-kweeksysteem ondersteunt ultralage dichtheid kweken van hippocampale neuronen gezaaid op poly-D-lysine micro-eilanden, waarbij neuronen vormen autaptic verbindingen die onderzoek cel kan vergemakkelijken -autonomous, netwerk-onafhankelijke mechanismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een gedetailleerd protocol voor de lange termijn de cultuur van ultra-lage dichtheid hippocampale glutamaat neuronen onder serum-vrije omstandigheden. Bij ~ 2000 neuronen / cm 2, de dichtheid ten minste twee maal lager dan de meeste lage dichtheid voor bereiding met of zonder glia steun van de bestaande literatuur 2,3,11,13,14 gerapporteerd. Naast het feit dat ultra-lage dichtheid, dit protocol is nieuw en belangrijk in twee opzichten. Eerst wordt geen glia feeder layer nodig als lag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
