qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 '플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
NSCLC (비 소 세포 폐암) 환자에서 낮은 생존율 고급 질환 불량을 조기에 발견 치료 1의 제한된 효능에 주로 기인한다. NSCLC 환자의 개체군에서 발견 된 EGFR 유전자의 활성화 돌연변이, 키나제 억제제 (TKIs)를 티로신 민감성을 부여하는 것으로 알려져있다. 불행히도, EGFR 돌연변이 NSCLC 환자의 대부분은 TKI 저항이 개발. 특히 이러한 상황에서, 정확한 진단이 필수적이다. 때문에 종양의 현지화에, 일반적으로 비소 세포 폐암에서 생검 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않습니다. 따라서, 몇몇 연구는이 생체 데이터를 획득하는 비 침습적 방법을 사용하는 것을 계속한다. 엑소 좀은 비 침습적 방법 (3) 진단 및 예후 값을 얻기 위해 조사 할 수있는 액체 생검 컴포넌트로서 기술되어있다.
전자의 – (100 나노 미터 직경 40) 엑소 좀은 nanovesicles 있습니다생리적, 병리 적 상태로 4 모두 다른 세포 유형으로 출시 ndocytic 기원. 그들은 단백질, 지질,의 mRNA 및 마이크로 RNA를 수행 할 수 있습니다. 또한, 몇몇 연구는 종양 세포, 혈관, 간질 및 세포 외 기질 리모델링 및 약제 내성 (5)의 성장과 생존에 영향을 미칠 수있는 종양 유래 엑소 좀의다면 발현 성 역할을 제안한다.
마이크로 RNA (miRNA가)는 대상의 mRNA의 3'- UTR 결합 열화 또는 비 번역 (6) mRNA의 선두, 전사 후 조절에 관여하는 짧은 비 코딩 RNA이다. 엑소 좀에의 miRNAs의 선택적 정렬 설명 하였다. 이러한 맥락에서 최근 관내 및 생체 내에서, 커큐민 처리 후 7 만성 골수성 백혈병 세포주에 의해 방출 엑소 좀 미르-21 (종양 효과를 갖는 공지의 miRNA)의 선택적 포장 입증되었다.
그만큼exosomal miRNA의 프로필은 기본 종양의 miRNA의 프로파일과 유사하며이 기능은 조기 진단 및 예후 3에서 악용 될 수 있습니다. 구체적으로, 실시간 PCR에 의해 특성화 할 수있는 가능성이있는 질병의 분자 프로파일과 상관 선택의 miRNAs 등. 다른 8 중에서 EGFR 돌연변이.
여기서, NSCLC 상관의 miRNAs 8-9 선택된 패널 분석 NSCLC 환자의 혈액에 방출 엑소 좀으로부터 분리 된 것이 기재되어있다. (가) 환자의 동의 보고서를 통보받은 후, 12 비소 세포 폐암 환자 6 건강한 대조군의 플라즈마, 분석 하였다. 엑소 좀 분리는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트 하였다. 엑소 좀을 분리하기 전에 혈장 샘플은 오염물의 miRNAs 순환을 저하시키기 위해, RNAse가 처리 하였다. 우리는 때문에 다른 TECHNI의 제한된 표준화에 상용 키트이 분석을 수행하기로 결정임상 샘플로 작업 할 때 특히 중요하다 QUES (예., 초 원심 분리). 이 키트는 RNAse가 저하하고, 따라서 엑소 좀 용해 후 exosomal의의 miRNAs을 저하 할 위험을 감소하는 테 K 처리를 포함한다. 마이크로 RNA 분석은 민감하고 특이 리얼 타임 PCR 분석에 의해 수행 하였다; 미르 1228-3p는 화학식 2에 따른 내인성 대조군으로 사용하고, 데이터는 정규화 된 – ΔΔct. 제어 값을 기준으로 사용되며, 그 결과를 대수 눈금으로 나타나있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 조합 된 프로토콜로는 NSCLC 환자의 혈장에서의 miRNA exosomal 분석을 수행 할 수 있었다. 이러한 데이터는 질병 상태를 반영 할 수 있지만, 추가 연구에 의해 확인되어야한다.
이 문서에서 사용되는 프로토콜은 엑소 좀 격리를위한 상업 키트를 기반으로했다. 그 이유는 다른 공지 된 분리 절차 (예., 밀도 구배 초 원심 분리) 제한된 표준화 선도 이상의 수동 절차를 필요?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
