分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

摘要

在过去的十年中，了解癌干细胞样细胞在肿瘤复发和治疗耐药性中的作用已成为备受关注的研究课题。本文描述了从头颈部鳞状细胞癌细胞系（HNSCC）中分离和鉴定癌干细胞样细胞亚群的方法。

摘要

尽管对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）进展的理解已取得进展，但由于局部复发和远处转移，其五年生存率仍然较低。为解释这种复发现象，一种假说认为是由于存在具有内在化疗和放疗抵抗性的癌干细胞样细胞（CSCs）。为了开发新的治疗策略，有必要建立能够验证靶向治疗有效性的实验模型，因此需要可靠的方法来识别和分离CSCs。为此，我们提出了一种从人HNSCC细胞系中分离CSCs的实验方案，该方案依赖于通过荧光激活细胞分选（FACS）进行的两次连续细胞分选组合。第一次分选基于CSCs高表达ATP结合盒（ABC）转运蛋白的特性，从而能够主动排出包括Hoechst 33342在内的活体DNA染料。通过该方法分选出的细胞被鉴定为一种 "侧群细胞" （SP）。由于SP细胞所占比例较低（<5%）的亲代细胞时，在进行第二次细胞分选前需进行增殖培养以扩增细胞数量。下一步可筛选出具有另外两种头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）干细胞特征的细胞 即 细胞表面标志物 CD44 的高表达水平（CD44^高) 以及醛脱氢酶（ALDH）的过表达^高）。由于单一标志物在分离肿瘤干细胞（CSCs）方面存在诸多局限性和缺陷，联合使用SP、CD44和ALDH标志物将为分离具有活力的CSCs提供一种有效工具，以用于后续的分析和功能实验。CSCs的干细胞样特性最终得到验证 体外 通过肿瘤球的形成和β-catenin的表达。

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球常见的恶性肿瘤，尽管现有治疗手段已取得进展，但晚期患者的预后仍然较差。尽管采用了包括手术、化疗放疗和靶向治疗在内的综合治疗方案，患者的总体5年生存率仍仅为约30%。近期研究表明，局部复发和远处转移可能与抗癌治疗后癌干细胞样细胞（CSCs）的存活有关¹。越来越多的证据支持在多种实体瘤（包括乳腺、脑、前列腺、肺、结肠、胰腺、肝脏和皮肤肿瘤）中存在具有干细胞特性的细胞（未分化状态、自我更新和分化能力以及端粒酶活性）^2-10。然而，CSCs的起源仍不明确^11,12。它们可能来源于正常干细胞的恶性转化^3,13，或由获得CSC样特征的肿瘤细胞去分化而来^14,15。因此，深入了解与CSCs相关的特异性通路，将有助于对耐药性HNSCC的早期诊断和治疗。

有研究提出，肿瘤干细胞（CSCs）还具有耐药表型，能够逃避常规化疗和放疗，与大多数肿瘤细胞相比更易导致肿瘤复发^16-19，并且主要定位于缺氧微环境²⁰。目前已有多种因素被用来解释CSCs的这种耐药性，例如倾向于静息状态、增强的DNA修复能力、上调的细胞周期调控机制以及自由基清除能力²¹。此外，一些致癌分子通路可能在CSCs中被特异性激活¹⁷。为了深入理解CSCs并开发更有效的靶向治疗策略，迫切需要建立可靠的方法来....

方案

所有动物实验均按照当地动物护理指南进行。本研究的所有细节均获得了法国伦理委员会CECCAPP的批准。

1. 通过Hoechst染料外排法筛选侧群细胞（SP）

1. 使用 Hoechst 33342 染料对 5000 万个细胞进行染色。
   1. 准备两个带有锥形底部的无菌 15 ml 离心管：一个标记为 "Hoechst"，另一个标记为 "Hoechst and Verapamil"。用无菌水配制 10 ml 的 5 mM 盐酸维拉帕米（Verapamil hydrochloride）溶液。准备干细胞培养基（CM）。
      1. 为制备 CSC 培养基（CM-CSC），按以下组分混合：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）:F12（1:3, v:v）、5% 胎牛血清（FCS）、0.04 mg/L 氢化可的松（hydrocortisone）、100 U/ml 青霉素、0.1 g/L 链霉素和 20 µg/L 表皮生长因子（EGFR）。
   2. 在超净工作台内，用胰蛋白酶消化细胞。吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并为 75 cm² 培养瓶加入 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5 g/L）。在 37 °C 下孵育 3 分钟。加入亲本细胞系所用的培养基以终止反应。使用细胞计数器计数细胞数量。
      1. 为制备亲本细胞系培养基（CM....

结果

由于亲本细胞系中肿瘤干细胞（CSCs）的比例极低，从头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中分离CSCs需要进行两次连续分选。第一次分选基于CSCs表达药物外排转运蛋白，能够排出Hoechst染料的特性。该步骤可获得占总细胞群0.1%–5%的细胞（图1）。在对Hoechst染料阴性细胞进行分选时，通过观察FSC-A与SSC-A点图来检查分选细胞的大小和颗粒度（图1A）。接着，利用SSC-W与SSC-H点图区分双联体及细胞碎片，并选中P1细胞群（图1B）。针对该P1细胞群，构建Hoechst Red-A与Hoechst Blue-A点图。在标记为“Hoechst”的样本管中，侧群（SP）表现为位于主细胞群左侧的一个侧臂（图1C）。当细胞经ABCG2转运蛋白抑制剂维拉帕米（Verapamil）处理后，该细胞群应消失（图1D）。碘化丙啶（PI）染色可用于排除PI阳性的死亡细胞，因为该群细胞在Hoechst Red.......

讨论

本方案描述了一种从特定细胞系中成功分离肿瘤干细胞（CSCs）的可靠方法，该方法可适用于其他头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系。分离得到的头颈部肿瘤干细胞适用于进一步的分子表征研究 体外 通过在免疫缺陷小鼠中移植进行功能验证¹⁹然而，可根据侧群细胞或CD44的不同，尝试一些相应的改进方法。^高/ALDH^高 亲本细胞系中存在的百分比。例如，如果某特定细胞系中侧群细胞的比例过低，则CD44^高/ALDH^高 可直接进行分选。本研究中使用的标记物可根据所研究的细胞系替换为其他合适的标记物，例如 CD133^{高 34} 或 CD10^{高 35}.

本方案基于两次细胞分选。在所测试的细胞系中，无法实现SP+CD44+ALDH三色分选。首先，此处测试的亲本细胞系中SP细胞比例低于5%，CD44阳性细胞比例低于10%^高/ALDH^高 SP中的细胞。因此，SP/CD44^高/ALD.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
优质胎牛血清	GE Healthcare	A15-151
水溶性氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
青霉素/链霉素（100倍浓度）	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM 培养基	Gibco	61965-026
F12 营养混合物（1倍浓度）+ GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	该溶液必须在使用前新鲜配制，因其极不稳定
肝素	StemcellTM Technologies	7980
B-27 添加剂（50倍浓度），不含维生素A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	腐蚀性，急性毒性（经口、经皮、吸入）类别4
盐酸维拉帕米	Sigma-Aldrich	V-4629	急性毒性（经口、经皮、吸入）类别3
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	急性毒性（经口、经皮、吸入）类别4
ALDEFLUOR 试剂盒	Stem Cell	1700
CD44-APC 人源抗体	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC 人源抗体	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 库尔特颗粒	Beckman Coulter	6605698
光学显微镜	Olympus	CKX31
SQ20B 细胞系	由 John Little’s 实验室惠赠	-
FaDu 细胞系	ATCC	HTB-43
低附着培养板	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva 软件 v8.0.1	BD Biosciences	-