我们提供了一种详细的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）觅食路径长度测定实验方案。本文讨论了实验动物的准备与处理方法、如何开展该测定实验以及数据分析方法。
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摘要
摘要
Drosophila melanogaster 幼虫路径长度表型是一种已建立的指标，用于研究遗传和环境因素对行为变异的贡献。幼虫路径长度检测最初被开发用于测量个体在觅食行为上的差异，这些差异随后被关联到 foraging 基因。幼虫路径长度是一种易于评分的性状，有助于以最低成本收集大样本量，适用于遗传筛选。本文提供了 Sokolowski 首次使用的幼虫路径长度检测当前方案的详细描述。该方案详述了如何可重复地处理测试动物、执行行为检测以及分析数据。此外，还举例说明了如何通过在检测前操控饲养环境来利用该检测方法测量幼虫对环境变化所表现出的行为可塑性。最后，本文讨论了合理的实验设计，以及可能影响幼虫路径长度的环境因素，如食物质量、发育年龄和日间效应等。
引言
自从发现以来 白色 1910年在托马斯·亨特·摩根（Thomas Hunt Morgan）实验室中发现基因的果蝇， Drosophila melanogaster (D. melanogaster), 已被用作研究多种生物过程分子与生理基础的模型。其受欢迎程度 D. melanogaster 主要源于大量且多样的遗传工具。 果蝇的 体型小、易于操作以及较短的世代周期使其成为遗传学研究的理想模型。同样重要的是 果蝇的 能够展示出包括哺乳动物在内的更复杂生物所表现出的多种表型，其中包括处于生物体与其环境之间交界面的复杂表型，如行为。因此，对果蝇的行为学研究极大地促进了我们对基因与环境如何介导行为的理解1.
最早的研究之一 D. melanogaster 通过测量幼虫的移动路径长度，研究幼虫行为中个体间在觅食策略上的差异2 取食过程中。路径长度定义为单个幼虫在酵母表面5分钟内移动的总距离。无论是实验室品系还是来自多伦多自然种群的果蝇，其觅食行为均存在差异，且路径长度的个体差异具有遗传基础。根据路径长度的定量分布，可区分出两种幼虫觅食表型，分别称为“游走型”（rover）和“静止型”（sitter）。在食物基质上，游走型幼虫的路径长度更长，活动范围更大，而静止型幼虫则相反。利用该路径长度检测方法，de Belle 等3 绘制了 觅食（for） 将这些个体行为差异背后的基因定位到染色体上的特定位置2 （24A3-24C5）。该 D. melanogaster 用于 该基因随后被克隆4 并揭示为一种cGMP依赖性蛋白激酶5，一种生理与行为的调节因子 果蝇 及其他生物6.
本文概述了最初由 Sokolowski2 建立的幼虫爬行路径长度检测的现行实验方案。尽管多年来该检测的某些方面有所改进，但其设计背后的核心理念始终未变。我们还提供了数据，以展示该检测在评估遗传和环境因素对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫觅食行为个体差异贡献方面的潜力。幼虫爬行路径长度检测方法简单、高效且结果稳健。单人可在四小时内轻松测试多达500只幼虫，且实验结果具有高度可重复性。该方法最初用于定位 for 基因，现可用于遗传筛选、数量性状位点作图以及基因与环境（GxE）相互作用的研究。此外，由于其操作简便且可重复性强，该检测也是本科生教学的宝贵资源。
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方案
1. 准备葡萄培养基平板和收集幼虫用的保藏瓶
- 制作饲养瓶时，在6 oz果蝇培养瓶的一侧打孔，孔径需足够插入果蝇小瓶塞以供通气（图 1D).
- 制作葡萄糖平板时，准备 250 ml 葡萄汁培养基（1.8% 琼脂，45% 葡萄汁，2.5% 乙酸，2.5% 乙醇）的制备方法：将琼脂、葡萄汁和大部分水煮沸，冷却至 70 ºC（冷却过程中持续搅拌），然后加入乙酸和乙醇，并加水定容至所需体积。
- 使用无针头的注射器填充35 x 10 毫米培养皿盖，直至葡萄汁培养基表面在盖缘上方形成穹顶状图1A).
- 将葡萄培养皿置于潮湿且密封的容器中，4 ºC保存备用（最多不超过2周）。
2. 食物平板的制备
- 准备标准果蝇培养基配方。
注意：为了检测培养基营养质量对路径长度的影响，我们使用了低营养果蝇培养基：10% 蔗糖、1.3% 琼脂、0.8% 酒石酸钾钠、0.1% 磷酸二氢钾、0.05% 氯化钠、0.05% 氯化钙、0.05% 氯化镁、0.05% 硫酸铁、5% 酵母和 0.5% 丙酸溶于水中；以及高营养果蝇培养基：1.5% 蔗糖、1.4% 琼脂、3% 葡萄糖、1.5% 玉米粉、1% 麦芽提取物、1% 大豆粉、3% 糖蜜、3.5% 酵母、0.5% 丙酸、0.2% Tegosept 和 1% 乙醇溶于水中。两种培养基均需高压灭菌后冷却至 50 oC，再加入丙酸、Tegosept 和乙醇。 - 将 40 ml 果蝇培养基倒入 100 × 15 mm 的培养皿中。
- 将培养基平板储存于潮湿且密封的容器中，4 ºC 保存直至使用（最多不超过 2 周）。
3. 准备测试平板
- 准备尺寸为 58 x 25 cm、厚 6 mm 的黑色亚克力板，板上设有 10 个直径为 10 cm、深 1 mm 的圆形凹槽，排列成 2 x 5 的布局，用于测试幼虫（图 1C）。
注意：若有 3 块或更多上述亚克力测试板，可同时测试最多 30 只幼虫。或者，也可使用直径为 10 cm 的培养皿进行幼虫测试，但此方法更为繁琐，且可同时测试的幼虫数量较少。 - 准备一块尺寸为 39 x 8 cm、厚 6 mm 的黑色亚克力刮棒，用于将酵母糊均匀涂抹在亚克力测试板上。
- 提前将 100 x 15 mm 培养皿的皿盖与皿底分离，以备用于记录幼虫的移动轨迹长度。
4. 建立亲本群体
- 在整个实验过程中保持培养条件恒定（例如25 ºC、60% 湿度、12:12 光照:黑暗循环的标准果蝇食物饲养条件下。
- 在相同的饲养条件下培养亲本群体。
- 收集100–150只雌性与50–75只雄性，饲养5±1天以获得最佳繁殖力。
- 让雌性和雄性果蝇在含有标准果蝇食物的6盎司培养瓶中交配过夜。
- 将果蝇转移至饲养瓶中，并固定葡萄培养基（在葡萄培养基上添加少量新鲜酵母糊可促进产卵）； 图1B) 用美纹纸胶带覆盖顶部（图1E).
- 将瓶子倒置放置（图 1F），葡萄板置于底部，以便成虫在葡萄板上产卵。
- 24小时后弃去第一个葡萄培养皿 并将一块新的葡萄培养板放入保藏瓶中。这块葡萄培养板将用于次日收集幼虫。
注意：葡萄平板需在22小时后清除幼虫 设置完成后，将培养板放置妥当，以便可在次日一早进行清理。例如，于中午12点设置培养皿，次日上午10点清除）。建议弃掉第一块葡萄培养皿，以避免雌虫可能滞留的卵，这些卵可能已处于较晚的发育阶段。
5. 从葡萄培养基平板收集一龄幼虫（L1）
- 在葡萄培养板设置后22小时，将其从瓶中取出，并放入60 × 15 mm的培养皿中。
- 在保持瓶上放置新的葡萄培养板，并涂上新鲜的酵母糊。
- 使用解剖探针清除并丢弃接种葡萄培养板上的所有幼虫。
- 将清除后的葡萄培养板在标准条件下孵育4小时 。
- 孵育4小时后，从葡萄培养板上挑选每种品系各100条L1幼虫，转移至食物培养板上。
- 将幼虫轻柔地放置在食物上（避免刺破食物或将幼虫埋入其中），并通过将幼虫均匀分布在食物培养板上来避免过度拥挤。
- 将食物培养板继续孵育，直至测试用动物处于开始游走前约10小时 的阶段。
注：在25 ºC条件下，游走前10小时 通常对应孵化后72–96小时 。确切的孵育时间应在实验开始前确定，方法是为每个品系收集一批初始幼虫，并记录其开始游走所需小时数（游走期幼虫会从食物中爬出，移动至培养板的侧壁或盖子上）。
注：如有需要，可通过重复步骤4.7至5.5，使用相同的亲本连续3–4天收集幼虫用于测试。每天应改变品系设置和测试的顺序，以避免测试顺序对路径长度造成影响。每天测试时均应包含相同的"对照"品系/品系，以控制日间差异的影响。 - 若需测试多个品系，应错开各品系的设置和幼虫收集时间，以便后续在适当的时间点对每个品系进行测试。
6. 幼虫路径长度测试
- 按1:2的质量与体积比将干活性面包酵母溶于水中。制备好的酵母糊应比煎饼面糊更稀，当将勺子从酵母糊中提起时，糊液应能滴落，并在表面留下丝带状痕迹，这些痕迹会迅速消失。
注意：酵母糊的稠度非常重要，应在整个实验过程中保持一致。根据酵母的品牌和批次不同，可能需要调整酵母与水的确切比例。 - 使用画笔从食物培养皿中轻轻挑取待测的第一种品系的幼虫。
- 将幼虫收集到一个培养皿中，并用清水轻轻冲洗以去除所有食物残留。
- 用1–2 ml清水快速清洗幼虫，然后用实验室擦拭纸轻轻吸干幼虫表面水分，以避免在将幼虫转移至测试板时带入水分。为避免造成应激，应保持幼虫处于湿润环境，但不可完全浸没于水中。
- 将三个测试板并排摆放，并为每个测试板设置5分钟计时器。
- 将酵母糊涂抹在测试板表面，使用涂布棒在每个测试板上均匀涂布一层薄薄的酵母糊，确保所有孔洞均覆盖有厚度一致的酵母层。
- 将一只幼虫轻轻放入每个孔的中央，在每个板上放置第一只幼虫后立即启动5分钟计时器。注意：每次可同时处理三个板，每种品系每次测试日可获得30个样本，最多可处理总计500只幼虫。
- 在每个孔上方盖上培养皿盖。
- 当计时结束时，在不取出幼虫的情况下，立即使用永久性记号笔描记幼虫在酵母层上留下的移动轨迹长度。描记顺序应与幼虫放置在测试板上的顺序一致。
- 描记速度应与放置幼虫时的速度保持一致。为了后续数据分析的一致性，所有轨迹长度应使用同一支记号笔进行描记，推荐使用永久性记号笔。
- 对每一种待测品系重复步骤6.2至6.8.1。在测试前立即从食物中挑取各品系幼虫，以避免饥饿效应对移动轨迹长度的影响。
7. 食物剥夺
- 如果在测试前需要对幼虫进行饥饿处理，请按照步骤 6.2 至 6.3 所述收集幼虫，但应提前相应的时间开始饥饿处理（例如，若需对幼虫饥饿处理 4 小时，则应在测试时间前 4 小时 收集幼虫）。
- 将清洗后的幼虫分为两组，将饥饿处理组置于含有 5 ml 1% 琼脂的 60 × 15 mm 培养皿中，对照组则置于含有 5 ml 标准食物的培养皿中。
- 在培养皿倒置的皿盖上放置重物（否则幼虫在寻找食物时可能会爬出）。
- 在预先设定的饥饿处理时间段内孵育，并按照步骤 6.2 至 6.9 所述进行后续测试。
- 若需测试多个品系，应错开各品系的饥饿处理起始时间，以便在合适的时间点对每个品系进行测试。
8. 数据分析
注意：本节介绍使用 ImageJ7 或 Fiji8 进行路径长度数据处理的分析方法，尽管也可使用其他软件。
- 使用透光板将所有从培养皿盖上描记的路径长度转移到白纸上（培养皿盖可用乙醇清洗后重复用于后续路径长度记录）。
- 在其中一张纸上绘制一条50 mm的直线作为参考线。
- 以300 dpi分辨率扫描路径长度图像，并保存为位图或TIFF格式的图像文件。
- 打开图像文件，选择 "Process" 选项卡 > "Binary" > "Make binary"。然后在 "Process" 选项卡下，选择 "Binary" > "Skeletonize"。此操作将生成一条宽度为一个像素的线条，无论原始描记线条的粗细如何。
- 确保每条路径长度均显示为连续的单一线条，无交叉点。
- 使用 "Straight line tool" 工具并用白色填充，以分离任何相交部分（可使用 "Wand"（描记）工具检查路径的连续性，整个路径应被高亮显示为黄色（图2））。
- 选择 "Analyse" 选项卡 > Set measurements，并选择 "Perimeter" 和 "Display label"。
- 选择 "Analyse" 选项卡 > "Set scale"，并选择 "Remove scale"。
- 在图像上仅选择参考线，然后选择 "Analyse" 选项卡 > "Analyse particles"，并选择 "Show: Outlines"、"Display results" 和 "Clear results table"。注意：输出结果将显示对应于50 mm标尺线的像素数量。
- 选择 "Analyse" 选项卡 > "Set scale"，在 "Distance in pixels" 中填入像素数，在 "Known distance" 中填入对应的实际距离（50 mm）。
- 最后，依次选择同一基因型的所有路径长度图，选择 "Analyse" 选项卡 > "Analyse particles"，并选择 "Show: outlines"、"Display results" 和 "Clear results table"。
- 通过选择区域内并填充为白色，移除所选区域内的任何文字标签或明显无关的标记（这些标记会被识别为路径长度）。
- 目视检查 "Outlines" 输出文件，以确认周长已被正确测定。输出结果将显示所选区域内每条路径长度图对应的路径长度（单位为mm）。该数据可轻松导出至电子表格，并使用任意统计软件进行分析。
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结果
漫游型与静止型个体行进路径长度的差异 用于 菌株及食物剥夺对路径长度的影响如图所示 图 3连续三天测试收集的数据显示出显著的品系效应（F(1,421) = 351.89，p < 2.20 × 10-16; 图 3A），其中漫游型个体的移动距离大于静止型个体。除了品系效应外，食物处理方式也存在显著影响（F(1, 421) = 461.62，p < 2.20 × 10-16; 图 3A），其中在测试前禁食四小时的幼虫的路径长度显著低于已进食的幼虫。此外，方差分析显示品系与处理之间存在显著的交互作用（F(1,423) = 9.78，p = 2 × 10-3），表明漫游型和静止型果蝇对食物剥夺的反应程度不同。
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讨论
本文所述的路径长度测定法为研究觅食行为提供了一种稳健且简便的测量方法 果蝇 幼虫。该方案遵循Sokolowski所述的一般方法学2，但此后在效率和实验对照方面已得到改进。据我们所知，该方法是目前唯一可用于测量幼虫路径长度的可用方法。路径长度实验方案的最初版本2, 3, 15, 16 在培养皿中测试幼虫，先用毛刷涂抹一层薄薄的酵母糊，随后使用玻璃涂布棒。本方案的较新版本10, 17 改用此处所述的Plexiglas板后，与使用培养皿和玻璃涂布棒相比，酵母层较厚，导致整体路径长度变短。尽管如此，rover（游走型）与sitter（定居型）表型之间的差异仍然保持，并且具有同等的可重复性。虽然使用Plexiglas板的操作更为简便、省力，但培养皿法所产生的更长路径长度有助于更清晰地区分rover与sitter表型，从而有利于将rover-sitter表型差异的遗传定位进行精细 mapping 用于 基因3使用Plexiglas测试板替代培养皿，并对路径长度轨迹进行计算分析，是该方法自首次建立以来协议中的主要改进之处，这两项...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对 MBS 的持续资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6 oz 果蝇培养瓶 | 费舍尔科技 | AS355 | |
| 果蝇小管塞 | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm 培养皿 | 法尔肯 | 351008 | |
| 100 x 15 mm 培养皿 | 费舍尔 | 875712 | |
| 60 x 15 mm 培养皿 | VWR | 25384-168 | |
| 解剖探针 | Almedic | 2325-58-5300 | |
| 酵母 | 实验室科技 | FLY-8040-20F |
参考文献
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