This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile optik süper çözünürlüklü görüntüleme kimyasal ve biyomedikal bilimlerde moleküler düzeyde süreçlerin görselleştirme için önemli bir teknolojidir. Ticari SIM sistemleri mevcut olmakla birlikte, özel ticaret sistemler daha iyi performans laboratuvar tasarlanmış sistemler, ikincisi genellikle görüntüleme sadakat ve hız açısından hem de kullanım ve genel amaçlı uygulamalar kolaylığı için tasarlanmıştır. Bu makale toplam iç yansıma (TIR) aydınlatma kullanır ve 100 nm ulaşan bir çözünürlükte üç renk 10 Hz kadar az görüntüleme yeteneğine sahip bir SIM sistemi inşa etmek derinlemesine bir rehber sunuyor. Nedeniyle SIM ve TIRF kombinasyonu, sistem rakip teknolojilere daha iyi görüntü kontrast sağlar. Bu özelliklere ulaşmak için, birkaç optik elemanlar mevcut tüm uyarma wav için aydınlatma ışık polarizasyon durumu ve mekansal yapısı üzerinde otomatik denetimini etkinleştirmek için kullanılırelengths. Donanım uygulanması ve denetimi tüm ayrıntılar maksimum kazanım kare hızını elde bir vurgu ile uyarma ışık deseni üretimi, dalga boyu, polarizasyon devlet ve kamera kontrolü arasındaki senkronizasyon sağlamak için verilmiştir. Sistem hizalama ve kalibrasyon için bir adım-adım protokolü sunulmuştur ve ulaşılabilir çözünürlük iyileştirme ideal bir test örnekleri üzerinde doğrulanmıştır. video oranı süper çözünürlüklü görüntüleme için yeteneği canlı hücreler ile gösterilmiştir.
son yarım on yıl içinde, süper çözünürlük mikroskopi olgunlaştı ve biyolog eline uzman optik laboratuarları taşındı. Ticari mikroskop çözümleri optik süper çözünürlük elde etmek için üç ana varyantlar için mevcuttur: tek bir molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM), emisyon tükenmesi mikroskobu (STED) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) 1,2 uyarılmış. SMLM photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi kolayca aşağı 20 nm, büyük ölçüde optik kurulum kolaylığı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü vaadi, en popüler teknik olmuştur. Tek molekül yerelleştirme yoluyla Ancak süper çözünürlük mikroskopi içsel ticaret-off ile birlikte gelir: uzaysal çözünürlük ulaşılabilir dolayısıyla zamansal çözünürlüğe sınırlayan, bireysel florofor lokalizasyonu yeterli sayıda biriktirme bağlıdır. Görüntüleme dinamik bir süreçtirbir yeterli de görüntüyü yeniden oluşturmak için bu süre yeterli yerelleştirme olayları elde edilirken hareket eserler önlemek için faiz yapısının hareketini örnek gerektiği gibi canlı hücrelerde es nedenle sorunlu olur. Bu gereksinimleri karşılamak amacıyla, canlı hücre SMLM gösteriler büyük ölçüde uyarma gücünü artırarak fluorofor photoswitching oranlarında gerekli artış almış ve bu sayede örnek yaşam sürelerini ve biyolojik alaka 3 sınırlayıcı, fototoksisite ve oksidatif strese sırayla açar.
SIM ve SMLM hem üzerinde STED'in net bir avantajı yaklaşık 60 nm örnek yanal çözünürlük için kalın numunelerde süper çözünürlük, görüntü 120 mikron 4 derinliğe kadar Organotipik beyin dilimleri elde edildi olmasıdır. SMLM veya SIM tek objektif uygulamaları ile bu tür derinliklerde görüntüleme olanaksız olduğunu, ancak tek-molekül ışık levha veya kafes ışık levha mikrofon ile ya mümkün olurfloroskop 5. Şimdiye kadar bu bakış 6 küçük alanları görüntüleme sınırlı olmasına rağmen video oranı STED da göstermiştir ve sinaptik vezikül hareketliliğini eşleştirmek için kullanılır olmuştur.
Hücre biyolojisi ve moleküler kendinden montaj reaksiyonlarında 7 uygulamalar için – belirli bir floresan Fotofiziksel özelliklerine bağlı değildir gibi birçok kez puan üzerinden yüksek zamansal çözünürlüğe sahip görüntüleme gerektiren 12, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) çok uygundur olabilir prob. SIM bu doğal avantajına rağmen, şu ana kadar kullanımı ağırlıklı olarak sabit hücreler veya yavaş hareket eden süreçleri görüntüleme sınırlı olmuştur. Bu piyasada mevcut SIM sistemleri sınırlamaları nedeniyle: Bu enstrümanların alım kare hızı gerekli sinüs aydınlatma modelleri yanı sıra optik muhafaza kutuplaşmayı üretmek için kullanılan ızgaralar dönme hızı ile sınırlı kalmıştır. Ticari SIM yeni nesilaraçlar hızlı görüntüleme yeteneğine sahip ama onlar merkezi görüntüleme tesislerine ama tüm pahalıya bulunmaktadır.
Bu protokol canlı hücrelerin bazal yüzeyindeki ince örneklerinde ve yakın hızlı süreçleri görüntüleme için esnek bir SIM sisteminin inşası için bir rehber sunuyor. Bu büyük ölçüde odak background sinyalinin out azaltır numune 13 içine hiçbir derin, 150, yaklaşık nm'den nüfuz bir aydınlatma deseni oluşturmak için toplam iç yansıma floresan (TIRF) kullanmaktadır. TIRF ile SIM birleştirerek fikri SIM kendisi 14 olarak neredeyse eski ama 2006 15 önce deneysel olarak fark değildi. 2009 yılında tubulin ve kinesin görselleştirmek için 11 Hz 16 ulaşmada kare hızları bildirildi TIRF-SIM ile elde edilen in vivo ilk görüntüler dinamikleri ve iki renkli TIRF-SIM sistemleri 17,18 sunulmuştur. En son olarak, bir tek renk iki ışınlı bir SIM s yapımı ve kullanımı için bir kılavuzistem 18'e kadar Hz 19,20 çerçeve oranlarını içeren sunuldu.
Burada sunulan kurulum TIRF-SIM çalıştırılabilir ikisi üç renk, 20 Hz SIM süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptir. Tüm sistem ters bir mikroskop çerçeve etrafında inşa ve bir piezo-çalıştırılan z sahne ile bir motorlu xy çeviri aşamasında kullanır. TIRF-SIM için gerekli sinüs uyarma desenleri oluşturmak için, sunulan sistem ferroelektrik uzaysal ışık modülatörü (SLM) kullanır. İkili ızgara desenler SLM görüntülenir ve ortaya çıkan ± 1 kırınım emirleri, süzülmüş geçirilen ve objektif lens TIR halka içine duruldu. Gerekli faz kaymaları ve ızgaralar rotasyonlar görüntülenen SLM görüntüyü değiştirerek uygulanır. Bu protokol, inşa etmek ve böyle bir uyarım yolu hizalamak açıklamaktadır emisyon yolunun uyum ayrıntıları ve optimum uyum sağlamak için test örnekleri sunuyor. Ayrıca de polarizasyon kontrolü ve bileşenlerinin senkronizasyonu ile ilgili sorunları ve yüksek hızlı TIRF-SIM özel zorluklar scribes.
Tasarım Hususlar ve Kısıtlamalar
Bu protokol sunulan TIRF-SIM sistemi monte etmeden önce, optik bileşenlerin seçimini belirleyen dikkate çeşitli tasarım kısıtlamaları vardır. Optik bileşenlerin tüm kısaltmalar Şekil 1'e bakınız.
Mekansal Işık Modülatör (SLM)
bu alt-milisaniye desen anahtarlama yeteneğine sahip olarak bir ikili ferroelektrik SLM Bu kurulum kullanılır. Gri Ölçeği nematik SLM'ler kullanılabilir ancak bu geçiş zamanlarını büyük ölçüde teklif azalttı. veya piksel kapalı her bir ikili fazda SLM periyodik ızgara deseni o ızgara bir faz difraksiyonu olarak çalışacaktır SLM görüntülenen nedenle eğer olay düzlem wavefront ofset ya π ya da 0 faz vermek olacaktır.
ent "> Toplam İç Yansıma (TIR) TIR elde etmek ve genliği azalan bir alan üretmek için, cam numunesi arayüzü uyarma kirişlerin gelme açısı önemli açıdan daha büyük olmalıdır . Bu fani aydınlatma desen gerekli minimum olay açısı ve dolayısıyla aynı zamanda maksimum boşluk veya dönem, ayarlar. Maksimum olay açısı
(Kabul açısı) tanımı hesaplanabilir objektif merceğinin sayısal açıklık (NA) ile sınırlıdır
. Bu Abbe formülüne göre elde aralığı, minimum kalıp belirler
NA ve dalga boyunu bağlayan
minimum desen aralığına <imgalt = "Denklem" src = "/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />. Pratikte, 1.49 NA yağ daldırma TIRF amacı yaklaşık 79 ° insidansı ve 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu kullanılarak 164 nm örnek en az model süresinin maksimum açı elde edilir. Bu iki açı gösterge TIR aydınlatma (yani. TIR halka) ve burada iki uyarım odakları doğru konumlandırılmalıdır elde ve her bir aydınlatma desen oluşturmak için döndürülür, üzerinde amacı arka açıklığı bir halka tanımlar.
TIRF-SIM görüntülerin İmar deseni dönme başına üç faz kaymaları minimum satın alınması dolayısıyla SLM desen süresi 3 ile bölünebilir olmalıdır gerektirir (Şekil 1). Örneğin, 488 nm aydınlatma 9 piksel ve 640 nm aydınlatma için 12 piksel bir dönem. makaslanmış ızgaralar kullanılarak aralık desenin alt piksel optimizasyonu dahil SLM desen tasarım kapsamlı bir tartışma içinSLM dalga boyudur gelen, tüm dalga boyları için TIR halkasının içinde olmalıdır ± 1 siparişlerin ancak sapma açısını iki uyarım odaklarının KNER ve ark., 16 ve Lu-Walther ve ark., 20 pozisyonun önceki iş görmek bağımlı. Standart SİM için çok renkli görüntüleme uzun dalga boyu için ızgara periyoduna optimize edilmesi ve daha kısa kanallar için bir performans kaybına tolere ile elde edilebilir. TIRF-SIM için, ancak, bir dalga boyu için optimize Diğer dalga boyu odakları artık TIR halka içinde olduğu anlamına gelir. odakları arka diyafram ve TIR halka içinde çapının% 95 altındadır Örneğin, 9 piksel ızgara periyoduna kullanılarak 488 Nm TIRF sağlamak için yeterli olmakla birlikte, 640 nm, bu dönem dışında odak konumu olacaktır açıklık. Bu nedenle, farklı piksel paterni aralıkları, her uyarım dalga boyu için kullanılmalıdır.
TIRF-SIM uyarma yolu hizalamaSon derece mikroskop gövdesinde (Şekil 1 'de DM4) dikroik aynanın pozisyonda küçük değişikliklere karşı duyarlı, çok daha çok geleneksel SİM bulunmaktadır. Dönen filtre küp taret kullanımı yerine kullanılan uyarma dalga boyları için özel bir sabit bir pozisyonda tutulur ve tasarlanmış bir tek, çok bantlı dikroik ayna kullanın, tavsiye edilmez. Sadece yüksek kalitede dikroik aynalar kullanılır esastır. Bunlar en az 3 mm kalınlığında substratlar gerektirir ve genellikle üreticiler tarafından "görüntüleme düz" olarak nitelendirilmektedir. Diğer tüm yüzeyler TIRF-SIM dayanılmaz sapması ve görüntü bozulmasına yol açar.
Polarizasyon Kontrol
TIRF-SIM ulaşmak için o optik eksene göre objektif öğrenci düzleminde azimut polarize kalacak şekilde aydınlatma deseni ile eşzamanlılık içinde uyarma ışık polarizasyon durumunu döndürmek için gerekli (yani. s-polarize). Polarizasyon kontrol optik hizalama motorlu bir dönme platformu 22, örneğin, kullanılan spesifik optik eleman üzerinde Pockel hücre 21 ya da bir yarım dalga plakası bağlıdır. Bu protokolde özel bir sıvı kristal değişken geciktirici (LCVR), kullanılan dalga boyu aralığında tam dalga (2π) geciktirici sağlamak için tasarlanmıştır 488 hızlı (~ msn) anahtarlama izin verdiği nm 640. sıvı kristal geciktirici kullanılıyorsa bir yüksek kaliteli bileşeni kullanmak esastır: standart bileşenler genellikle yol açar kamera maruz kalma süresi uzunluğu boyunca sabit bir geciktirici vermek için yeteri kadar sabit değildir, bir aydınlatma desen ve düşük modülasyon kontrast dışarı bulanıklık . Sıvı kristal geciktiriciler da güçlü sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklık kontrolü inşa gerektirir.
senkronizasyon
lazerler SLM ile senkronize olması gerekir. İkili ferroelektrik SLM'ler dahili s tarafından dengelenirdevlete ve devlet dışı bir arasındaki büyüleyici. piksel sadece ya onların ya da devlet dışı değil interframe anahtarlama süre içinde yarım dalga plakaları hareket ederler. Bu nedenle lazerler nedeniyle sadece piksel ara durumuna desen aksine bir azalma engellemek için SLM sinyal Enable LED üzerinden açma / kapama durumlarında devreye sokulmalıdır. lazerler dijital şekilde modüle edilmiş olamaz bir akusto-optik modülatör (AOM) alternatif olarak bir hızlı çekim olarak kullanılabilir.
Lensler seçimi
Bu kısıtlamaları dayanarak, örnek düzlemde üzerine SLM uçağın gerekli demagnification istenen aydınlatma modelleri tespit edilebilir üretmek. Bu görüntü röle teleskop ve uyarma kondenser mercek L5 iki lensler L3 ve L4 odak uzunlukları hesaplanmasını sağlar. Bu sistemde bir 100X / 1.49NA yağ daldırma objektif lens 488 nm ve 640 nm uyarma ile kullanıldığında, bu nedenle 300 ve 140 mm odak uzunlukları kullanırL4 ve L3 ve örnek düzlemde 38 nm'lik bir SLM piksel büyüklüğüne eşittir 357X toplam demagnification vererek L5 için 300 mm, için. lenslerin bu arada kullanarak, SLM sırasıyla 70 ° ve 67 ° lik açılarda karşılık, 488 nm aydınlatma ve örnek 172 ve 229 nm desen aralıklarını vermek nm 640 için 12 piksel 9 dönemleri ızgara. Cam suyu arabirimi için, kritik açı Bu nedenle, bu iki desen aralıkları, her iki dalga boyları için TIRF uyarma izin 61 °, ve dalga boyu bağımsızdır. 37 ° C üzerinde ya da, eğer, bir düzeltme yaka ile donatılmış bir objektif lens lamel kalınlığı varyasyonları getirdiği küresel sapmaları düzeltilmesi için yararlıdır.
görüntü İmar
Ham SIM veri elde edildikten sonra bu iki aşamalı bir süreç içinde süper çözülmesi görüntüler oluşturmak için hesaplamalı çaba meselesidir. İlk olarak, aydınlatma patern belirlenmelidirHer görüntü ve ikinci SIM spektrumunun bileşenleri ayrılmalıdır ve etkili OTF desteği (-parçalar Şekil 6) çift olarak uygun recombined.
süper çözülmesi frekans bileşenleri örtüşen bileşenlerin kalıntı parçalarının neden olduğu eserler önlemek için karışmamış kadar doğru mümkün olması olarak öngörülen aydınlatma desen kesin bilgi, her şeyden önemlidir. Biz aydınlatma desen her biri için bulunacak olan Gustafsson ve ark. Kısacası 23, normalize iki boyutlu sinüzoid açıklar aydınlatma parametreleri bir dizi ile getirilen prosedür izlenerek ham görüntü verilerinden bir posteriori parametreleri belirlemek uyarma desenleri
:
Bu vesile ile ve
saçak kontrast ve sırasıyla her görüntü m cafeye desen açıklar. dalga vektörü bileşenleri,
ve
Sadece farklı yönlerde ile değiştirmek
desen ve tenekenin aksi sabit olduğu kabul. kaba üst üste optimize etmek için çapraz korele görüntü birine altpiksel vardiya uygulayarak rafine ham görüntü spektrumları bir çapraz korelasyon yapılır dalga vektörü, bileşenlerini belirlemek. Bu gerçek uzay faz geçişlerini çoğalması ile yapılır
Bu fre bir altpiksel kaymasını teşvikfrekans-alan. gerçek model tahmini önce dalga vektörlerin iyi bir tahmin olması yararlıdır ve bu bir floresan boncuk tabakası görüntüleme bulunabilir unutmayın.
kaymıştır desenleri arasındaki faz adım olarak Yani.
Frekans bileşenlerinin ayrılması "Faz ekseni" birlikte bir Fourier Dönüşümü ile gerçekleştirilebilir. küresel faz
ve saçak kontrast
Daha sonra, farklı bileşenlerin karmaşık bir doğrusal regresyon kullanılarak belirlenebilir. Bireysel ayrılmış bileşenler daha sonra genel bir Wiener filtresi kullanılarak birleştirilir. genelleştirilmiş Wiener filtrenin her iki parametre çıkarma ve uygulama ayrıntılı bir açıklama için biz Gustafsson okuyucu bakınve ark., 23, aynı algoritma kullanılır.
Böyle bu protokolde ayrıntılı kurulum olarak özel yapılmış TIRF-SIM sistemleri piyasada mevcut mikroskoplar ile karşılaştırıldığında yüksek hızda çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptirler. süper çözümün tekniğiyle, SIM artısı zamansal çözünürlüğü gibi tek bir molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) veya uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopi gibi noktası tarama yöntemleri (ve diğer yöntemlere göre, fluorofor fotofizikten ile sınırlı değildir, yani STED). renkli görüntüleme basittir, böylece bu tekniklerin aksine, SIM photoswitchable ya tükenebilir florofor gerektirmez. Burada bildirilen 2 iyileştirme faktörü aksine SIM ve multifokal SIM kesit gibi optik olmayan TIRF-SIM sistemleri, genellikle uygulamada 1.7 kat veya daha az çözünürlüğü iyileştirmeler elde edebilirsiniz ve ticari sistemler de sistemden daha sık yavaş ve daha az esnektir Bu protokolde sundu.
"> Bu tekniği uygulamak iki ana zorluklar öncelikle optik hizalama işlemini tüketen bir zahmetli ve zaman gerektirir objektif arka diyafram, TIR bölgesi içinde altı SIM kirişlerin hassas konumlandırma için gerekliliktir. İkincisi, yüksek model kontrast üretmek için örnek de, polarizasyon rotasyonu düşük NA 2D-SIM sistemleri için, polarizasyon rotasyonu doğrusal polarizasyon yönlendirme dikkatli seçimi ile önlenebilir. esastır, ancak bu TIRF-SIM 25 imkansız hale gelir. yüksek hızlı renkli görüntüleme için, elektro optik polarizasyon kontrolü gereklidir ve bu sistemin karmaşıklığı ve gider artırır.tekniğin sınırlamaları
TIRF SIM geleneksel TIRF gibi doğal, biyolojik yapılar ve kaybolan alan 150-200 nm penetrasyon derinliği ile aydınlatılabilir bazal hücre membranında bulunan işlemlerin bir gözlem ile sınırlıdır. SüreSIM genellikle STED veya SMLM, yanal çözünürlük iki katına hala geleneksel TIRF mikroskopi ile karşılaştırıldığında en az 4 kat 5 ile fotonların gerekli sayısını artırmak değil, ya daha hücrelere daha az photodamaging olarak kote edilir. Kısa pozlama süresi ile yüksek kare hızlarında görüntüleme için, bu foton artış, aydınlatma şiddetleri kullanımını zorunlu kılmaktadır. Herhangi bir flüorofor sabit veya yavaş hareket eden numune, yüksek parlaklık fluoresan protein ya da geliştirilmiş Fotostabilitesi sonraki nesil sentetik boyaların SİM görüntüleme için kullanılabilir olsa da canlı hücre görüntüleme için tavsiye edilir.
Bu uygulama, 20 Hz fazla SIM kare hızlarında tek bir renk görüntüleme kapasitesine sahip olsa da, sunulan sisteme çok renkli görüntüleme motorlu emisyon filtresi tekerleğin sviçleme zaman ile sınırlıdır. Nedeniyle sCMOS kamera çipi büyük boyutu, bir çok bantlı emisyon filtresi ve görüntü bölme optik kullanılması mümkün ve eşzamanlı i izin verecekHiçbir hız cezası anda birden fazla dalga boyları ile maging. Bir başka olasılık farklı uyarma lazerler alternatif ve ikaz ışığı reddetmek için bir çok bantlı çentik filtresi kullanmak olacaktır. Bu uygulamada, bir ikili ferroelektrik SLM kullanımı da uygun değildir. gelen ışık en mekansal maske ile filtrelenir sıfır sıralı yansıması olduğu şekilde bu tür bir SLM sapma verimliliği, son derece düşüktür. Çok yüksek kare hızı gerektiren uygulamalar için, bir görüntüleme hızı, bu nedenle, lazer diyotları çıkış gücü ile sınırlıdır. SLM da uzak piksel olarak ideal bir yarım dalga plakaları faaliyet yok 550 nm dalga boyunda tasarım gelen dalga boyları için kutuplaşma bazı ekliptiğinde tanıtır. Bu ek bir LCVR kullanılarak telafi edilebilir olsa da, ideal bir çözüm desen jeneratör olarak bir dijital mikro-ayna cihazı (DMD) kullanımı olabilir.
Olası değişiklikler
kurulum preseBurada nted esnek ve daha kolay gibi 3D-SIM, hızlı 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) ve non-lineer SIM (NL-SİM) kadar diğer görüntüleme yöntemleri 21,34,35 uygulanabilir ticari araçların daha değiştirilmiş olduğunu.
2D-SIM hızlı periferik endoplazmik retikulum gibi yapılar hareketli, nispeten düz görüntüleme için uygun olabilir. periferik ER nedeniyle düz yapıya TIRF kaybolan alan, ancak kullanılarak aydınlatılabilir daha hücre içinde derin yatıyor önemsiz out-of-odak arka plan ile standart 2D-SIM kullanılarak görüntülenebilir. Ayrıca, geliştirilmiş optik kesit rekonstrüksiyon algoritmaları kullanılması ışığı optik kalın örnekleri, olsa eksenel çözünürlük iki katına 21 gerekmez 2D-SIM kullanımını genişletmek out-of-odak bastırmak için.
MSIM, örnek uyarma odaklarının 36 seyrek kafes ile aydınlatılmıştır. Bu yöntem SM (sadece mekansal maske kaldırarak uygulanabilir) Ve polarize bunu yerine. SLM şimdi bir genlik modülatörü olarak faaliyet göstermektedir. SLM görüntülenen dijital SIM ızgaralar görüntü düzleminde bir kırınım sınırlı odak boyutuna eşit olacak şekilde seçilmiştir noktalar boyutu ile, noktalar 2B kafes ile ikame edilmiş olabilir. Şekil 7A, 4 x 4 piksel kareler kafes 13.62 um fiziksel SLM piksel büyüklüğü göz önüne alındığında, numune üzerine demagnified zaman 150 x 150 nm kırınım sınırlı odakları oluşturur SLM (ek) görüntülenir. uyarma odakları sonra SLM üzerinde kafes deseni kaydırarak tercüme edilebilir ve bu görüş tüm alanını aydınlatmak için birden çok kez tekrarlanır. Görüntüler her tercüme desen pozisyon için edinilen ve yığını olan bir faktör kadar geliştirilmiş çözünürlüğe sahip bir yeniden görüntü elde etmek için post-işlenmiş ve düşük ışık eşdeğer widefield görüntüye göre out-of-focusKazanım süresi ham kare çok sayıda nedeniyle artan olmasına rağmen 30. Bu yöntem, standart SIM böyle lekeli kırmızı kan hücrelerinin (Şekil 7C) olarak örnek düşük kontrastlı yapılar için, elverişsiz olduğu için kalın, yoğun örnekleri görüntüleme için yararlı olabilir (Bu durumda, 168 = N cinsinden) görüş alanı başına gereken.
Li ve arkadaşları tarafından en son sunulan Son olarak, kurulum, yüksek Na doğrusal TIRF-SIM veya desenli aktivasyon doğrusal olmayan bir SIM (PA NL-SIM) ya sağlamak için modifiye edilebilir. Bir ultra 1.7 NA objektif veya ilave kullanımıyla 405 nm fotoaktivasyon lazer ve SLM ızgara desen 35 dikkatli optimizasyonu.
gelecek Uygulamaları
SIM hala hızla gelişen bir tekniktir ve yaşam bilimleri birçok uygulama gelecekte etkin olacak. tekniğin hızı, çözünürlük ve kontrast geliştirmeleri ve standart fluorophores m kullanarak yeteneğiEAN Biyogörüntüleme için, SIM böyle konfokal ve geniş alan platformları gibi geleneksel birçok mikroskop sistemleri yerine ayarlanmış olduğundan emin olun. Ticari SIM sistemleri önemlisi, onlar değiştirilmiş ve bu alanda en son araştırma gelişmeleri uygulamak için geliştirilecek esnek olmayan, ancak, birçok araştırma laboratuvarlarının mali yetmeyeceği, üstün teknik özellikleri ile bugün zaten mevcuttur ve. Onlar da gerekli yetenek, kenar yaşam bilimleri araştırma kesme genellikle kritik bir darboğaz 'eldeki deney için uyarlanabilir' için yoksundur. Burada anlatılan sistem özellikle de örneğin malzeme ve fiziksel bilimler, yüzey kimya okumak için, sulandırılmış iki katmanlı sistemleri in vitro çalışmalar için, hücre yüzeyine yakın dinamik süreçleri incelemek için uygun olacaktır. 2B malzeme ve diğer birçok uygulama.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Leverhulme Güven, Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi hibe ile desteklenmiştir [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Araştırma UK [aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] ve Tıbbi Araştırma Konseyi [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Biz HEK293 kültürünün hazırlanması için sırasıyla LifeAct-GFP transfeksiyonu ve sitozolik-GFP hücrelerinin E. Avezov ve M. Lu teşekkür ve W. Chen. Biz de yararlı tartışmalar ve öneriler için mikroskop tasarımı ile yardım için K. O'Holleran teşekkür ve L. Shao ve R. Heintzmann.
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |