Microtumors使用3D人体Biogel培养体系和病人源性胶质母细胞瘤的Kinomic剖析和药物反应测试的生成

Summary

患者来源的多形性胶质母细胞瘤异种移植物可以使用 3D 人生物凝胶培养系统小型化为活的微肿瘤。这种体内样 3D 肿瘤检测适用于药物反应检测和分子分析，包括肌组学分析。

Abstract

使用患者来源的异种移植物对癌症进行建模为癌症生物学和药物反应性提供了重要的见解。但是，它们耗时、昂贵且劳动密集。为了克服这些障碍，许多研究小组已转向癌细胞的球状体培养。虽然有用，但肿瘤球状体或聚集体不会复制体内发现的细胞-基质相互作用。因此，利用细胞外基质支架的三维 （3D） 培养方法为研究提供了更真实的模型系统。从皮下或颅内异种移植物开始，肿瘤组织解离成类似于癌症干细胞神经球的单细胞悬液。然后将这些细胞嵌入人源性细胞外基质 3D 人生物凝胶中，以产生大量微肿瘤。有趣的是，微肿瘤可以培养约一个月，具有高活力，可用于使用标准细胞毒性测定法（如 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物 （MTT） ）进行药物反应检测，以及使用钙黄绿素-AM 进行活细胞成像。此外，它们可以通过免疫组织化学进行分析或收获用于分子分析，例如基于阵列的高通量激酶组学分析，此处也对此进行了详细说明。因此，3D 微肿瘤代表了一种多功能的高通量模型系统，与传统方法相比，它可以更紧密地复制体内肿瘤生物学。

Introduction

最常见的原发性脑恶性脑肿瘤是III级星形细胞瘤和Ⅳ级胶质母细胞瘤 （成胶质细胞瘤或GBM）。这些肿瘤提供与12之间平均一年的生存预后差- 15个月，在美国的^1-3电流疗法GBM。多模态治疗包括手术，放疗和化疗，包括替莫唑胺（TMZ）和激酶靶向剂。激酶信号经常失调在GBM，包括在表皮生长因子受体（EGFR），增加血小板源生长因子受体（PDGFR）信令，增加的磷脂肌醇-3-激酶（PI3K），并与扩增的肿瘤的子集或激活突变肿瘤通过血管内皮生长因子受体（VEGFR），以及其他激酶驱动路径^4-6支承血管生成信令。当前在体外和体内模型中经常失去这些代表性的改变 ^{7。此外，遗传分析没有提供可能反映出遗传和表观遗传变化并不总是在蛋白活性的水平，其中大多数激酶靶向剂直接作用预测的变化，并且其中与其它作用机制的治疗可充当预期的效益间接的影响。}

可以传代无限传统的永生化细胞系一直是药物测试标准，由于其易于维护和重现性。然而，该模型从选择用于快速增长，从原来的肿瘤有很大的不同的细胞的高营养（和人工的）的生长环境受到影响。因此，出现了在显影反映一个更复杂的肿瘤生物学系统如存在于病人更现实的模型系统相当大的兴趣。肿瘤异种移植物直接从小鼠生长的原发肿瘤（"xenoline，"以病人为衍生异种移植或PDX）provi开发德一多个反射模型系统，特别是在癌症治疗的设置，因为它们被认为更可....

Protocol

注:所有异种移植治疗的评价是使用胶质母细胞瘤原位肿瘤模型上的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1.患者来源的GBM异种移植细胞的分离

1. 试剂的制备
   1. 重新构成胶原酶我在无菌水中的5毫克/毫升和无菌过滤的浓度。在-20℃1ml等份存储（终浓度为100毫升的酶溶液50微克/毫升）中。
   2. 在2ml溶解100微克表皮生长因子（EGF）的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。商店在100μl（5微克/ 100微升）在-20℃等份为10纳克/毫升的最终浓度。
   3. 溶解100微克在2毫升的FGF-β的无菌PBS中。商店在100μl（5微克/ 100微升）在-20℃等份为10纳克/毫升的最终浓度。
   4. 添加下面的一一瓶500毫升的Neurobasal医学的IA（NBM），以制备完整的NBM:不含维生素10ml的B-27补充，将5ml N2添加剂，100μl的EGF，100微升成纤维细胞生长因子（FGF） - 基本，将5ml两性霉素B，0.5 ml庆大霉素，加入5ml L-谷氨酰胺。
   5. 结合配制新鲜酶液98.5毫升的PBS，1 ml胶原酶-1加入0.5ml 10倍胰蛋白酶/ EDTA，并通过0.22微米孔径过滤器进行过滤消毒。
   6. 制备或获得的小体积的无菌的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），用7％胎牛血清（FBS）和1×PBS中无钙或....

Results

我们已经表明，3D biogel培养系统支持多种细胞类型的长期生长和功能。在这个合作项目，来自患者的GBM xenolines（PDX）用于生产数百microtumors的。解离的细胞（3×10 ^5个 ），或神经球（40 - 50）包埋在biogel珠（2mm）和之后快速凝胶化它们在一个NB-介质填充定制的生物反应器中培养。细胞活力（钙黄绿素-AM），生长曲线（MTT），和kinomic基于阵列活性分析进行了测定。 PDX microtumors维持>3周多的组织和高活力（> 80％）。我们认为，这在体内样生物学是由于维护三维细胞矩阵架构（不可能的2D或球体文化）。它也被观察到，3D肿瘤难以生产具有脆弱的凝胶状蛋白质骨架，这可能是由于缺少Ⅰ型胶原蛋白^14。的话筒的工作方案rotumor使用PDX细胞和三维biogel系统生产总结于图1和离解过程是在图2中描述。

Discussion

在协议中的关键步骤主要涉及microtumor代，以及药物剂量和维护。因为microtumor珠粒是脆弱的，容易撕裂，需要在检测和维修都发育阶段特别小心。如果在这些过程之一中出现错误，实验解释可能会受到损害，从而导致延长或实验的不必要的重复，甚至排除的数据。

修改和排查，尤其是microtumor发展过程中，包括为使用使得microtumor珠的自定义工具疏水性的设计和生产。这个工具允许更快，更准确的生产microtumors的。此外，小的修改对维持microtumors的帮助加快变换媒体和给药的细胞的过程。几个这些修改包括，但不限于，用多电子移液器除去，并从96孔板并更换介质预混合新鲜药物给药方案，并在一个相应2毫升96孔板布置2个解决方案。

在3D建模的培养条件主要优化包括确定药物化合物合适的剂量，因为有2D建模和3D建模之间的差的关系。因此，连续稀释建立了剂量滴定曲线通常是必要为移动二维模型系统到3D microtumor模型。

考虑与从鼠标收获xenoline肿瘤.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胶原酶-I	Sigma-Aldrich	CO130
胰蛋白酶 EDTA （10x）	Invitrogen	15400-054
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022
N-2 添加剂	Life Technologies	17502-048	1x 终浓度
B-27 添加剂，不含维生素 A	Life Technologies	12587-010	1x 终浓度
人 FGF-basic	Life Technologies	PHG0266	10 ng/ml 终浓度
重组人 EGF	Life Technologies	PGH0315	10 ng/ml 终浓度
L-谷氨酰胺	康宁 Cellgro Mediatech	25-005-CI	2 mM 终浓度
Fungizone	Omega Scientific	FG-70	2.5 µg/ml 终浓度
青霉素 链霉素	Omega Scientific	PS-20	100 U/ml 青霉素 G， 100 µg/ml 链霉素终浓度
庆大霉素	Life Technologies	15750-060	50 ng/ml 终浓度
MTT	Life Technologies	M6494	在 PBS 中制备至 5 mg/ml 并无菌过滤，1 mg/ml 在孔中
SDS	Fisher	BP166	用于 MTT 裂解缓冲液，在 0.01 中制备至 10% M HCl，5%
HCl	孔 Fisher	A144SI-212	用于 MTT 裂解缓冲液，制备至 0.01 含 SDS 的 M，孔中为 5 mM
钙黄绿素 AM	Life Technologies	C1430	1 mM 在 DMSO 储备液中，2 &微;M 在 PBS 染色溶液中，1 &微;M in well
Halt's 蛋白磷酸酶抑制剂混合物	Pierce ThermoScientific	78420	1：100 MPER比例
Halt 蛋白蛋白酶抑制剂	Pierce ThermoScientific	87786	1：100 比例溶于 MPER
哺乳动物蛋白提取试剂 （MPER）Pierce	ThermoScientific	PI78501
盼蓝	Pierce ThermoScientific	15250-061
DMSO	Fisher	BP231	用于钙黄绿素 AM 和化合物
溶解不含 Ca/Mg Lonza		的磷酸盐缓冲盐水17-517Q	用 MiliQ 超纯水稀释至 1 倍，并无菌过滤（用于细胞培养）
含 Ca/Mg 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水	Cellgro Mediatech	20-030-CV	用 MiliQ 超纯水稀释至 1 倍（用于固定前洗涤）
10% 中性缓冲福尔马林	方案	032-060
盼蓝	Pierce ThermoScientific	15250-061
高密度石生物凝胶	Vivo Biosciences	HDHG-5
Halt 蛋白磷酸酶抑制剂	Pierce	78420
Halt 蛋白蛋白酶抑制剂	Pierce	87786
哺乳动物蛋白提取试剂 （MPER）	Thermo Scientific	78501
蛋白酪氨酸激酶 （PTK） 阵列分析芯片	PamGene	86312
PTK 激酶缓冲液	PamGene	36000	300 µl 10x PK 缓冲液原液 2.7 ml dH2O，PTK 试剂盒的目录号
ATP	PamGene	36000，PTK	试剂盒的目录号
PY20-FITC 偶联抗体	PamGene	36000，PTK	试剂盒的目录号
：PTK 添加剂	PamGene	32114，PTK-MM1
管（10x BSA），	PTK 试剂盒
的 PamGene 36000 目录号丝氨酸/苏氨酸激酶 （STK） 阵列分析芯片	PamGene	87102
STK 激酶缓冲液	PamGene	32205	STK 试剂盒的目录号
STK 一抗混合物（DMAB 管）	PamGene	32205	STK 试剂盒的目录号
FITC 偶联的二抗	PamGene	32203
STK-MM1 管 （100x BSA）	PamGene	STK 试剂盒的	32205
STK 抗体缓冲液	PamGene	32205	STK 试剂盒的目录号
设备
#11 刀片，无菌	Fisher	3120030
#3 手术刀手柄，无菌	Fisher	08-913-5
100 mm 玻璃培养皿	Fisher	08-748D
半弯曲镊子	Fisher	12-460-318
胰蛋白酶消化瓶	Fisher	10-042-12B
磁力搅拌器	Fisher	14-490-200
3/4" 搅拌棒	Fisher	14-512-125
B-D 细胞过滤器	Fisher	#352340
B-D 50 ml 离心管	Fisher	#352098
PamStation 12	PamGene
BioNavigator 6.0 基因分析软件	PamGene
Evolve 激酶检测软件	PamGene
UpKin App软件（上游激酶预测）	PamGene
gentleMACS解离器	Miltenyi Biotec	130-093-235
旋转式细胞培养系统（RCCS）	合成康	RCCS-D	，含10 ml一次性HARV