连续波ium激光加热培养细胞以研究细胞热效应

Summary

这里介绍了使用1.94μm连续波激光辐射在培养皿中加热细胞的原始实验装置。使用这种方法，可以研究不同热暴露后视网膜色素上皮（RPE）细胞的生物反应。

Abstract

这里介绍一种使用1.94μm连续波ium激光加热培养细胞进行生物评估的原始方法。钍激光辐射被水强烈吸收，培养皿底部的细胞通过热扩散加热。直径为365μm的激光纤维设置在培养皿上方约12cm处，没有任何光学元件，使得激光束直径几乎等于培养皿的内径（30mm）。通过在每个实验中保持一定量的培养基，可以以高度可重现的温度升高来照射细胞。

为了校准每个功率设置的一个细胞培养皿中的温度升高及其分布，在不同位置和细胞水平的10秒照射期间测量温度。使用数学图形软件表示温度分布节目，其文化菜肴的格局是高斯形式。激光照射后，可以进行不同的生物实验来评估温度依赖性细胞反应。在本手稿中，介绍了活力染色（ 即区分活细胞，凋亡细胞和死细胞），以帮助确定不同时间点后细胞凋亡和死亡的阈值温度。

该方法的优点是温度和加热时间的精确度以及其在整个细胞培养皿中加热细胞的高效率。此外，它允许学习各种各样的温度和时间，这可以由计算机操作系统良好控制。

Introduction

了解温度依赖性细胞生物学反应对于成功的高热治疗非常重要。用于眼科的热激光视网膜激光凝固是医学中最成熟的激光治疗之一。视网膜激光治疗使用可见光，主要由绿色到黄色波长。光被视网膜色素上皮（RPE）细胞中的黑色素高度吸收，其形成视网膜的最外层细胞单层。医学界和研究人员近来对非常温和的热辐射（sub-visible光凝）感兴趣，作为不同种类的视网膜疾病^1,2的新治疗策略。按照这种趋势，我们的兴趣在于在精确温度控制下，即温控光热疗法（TC-PTT）的技术在低温加热RPE细胞。

最近光电我们研究所的声学技术允许实时测量视网膜辐射部位的温度升高。这样可以控制照射期间的温度升高³ 。然而，由于由于不可能测量和控制温度，以前没有考虑过由致死的RPE细胞引起的视网膜上的亚致死热疗，热激光照射后RPE细胞的温度依赖性细胞反应具有迄今为止研究很少。此外，不仅没有详细讨论温差，而且在致死和致死辐射后存活细胞的细胞行为的差异。因此，为了收集基于TC-PTT的治疗的科学证据，我们的目的是通过体外实验设置来阐明温度依赖性RPE细胞的生物反应及其机制。

对于t他的目的是建立满足以下条件的电池加热装置:1）快速升温的可能性，2）精确控制的时间和温度，3）生物实验检测细胞数量相对较多。关于加热方法，临床激光，例如倍频Nd.YAG激光（532nm）....

Protocol

RPE细胞培养

1. 从猪眼中分离RPE细胞
   1. 从当地屠宰场获取新鲜去核的猪眼。保持凉爽（4°C），并在黑暗的环境中。
   2. 用剪刀去除细胞外组织，并将眼睛浸泡在消毒溶液中5分钟。
   3. 将眼睛置于无钙和镁（PBS（ - ））的无菌磷酸盐缓冲盐水中直至使用。
   4. 使用手术刀，在角膜缘后方约5毫米处穿透巩膜。用剪刀切割，平行于角膜缘，切除眼睛的整个前部。
   5. 去除眼睛前部（ 即角膜和晶状体）和玻璃体。加入1 mL PBS（ - ），轻轻取出神经视网膜。
      注意:这个"眼杯"，由巩膜，脉络膜和RPE组成，现在已经准备好了。
   6. 在P中加入预热（37℃）0.25％胰蛋白酶BS（ - ）到眼杯。调节体积，使眼睛杯的大约80％充满这种胰蛋白酶溶液。
   7. 使用胰蛋白酶溶液将眼杯在5％CO ₂培养箱中于37℃孵育10分钟。
   8. 从培养箱中取出眼罩，用含有0.05％胰蛋白酶+ 0.2％乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA·4N）的PBS（ - ）溶液代替0.25％胰蛋白酶溶液。将孵育器中的眼杯孵育45分钟。
      注意:45分钟后，RPE细胞将松弛地连接到Bruch膜上，或者已经分离并漂浮在胰蛋白酶-EDTA溶液中。
   9. 通过温和吸液收集RPE细胞。将细胞和溶液收集在装有10mL培养基（含有L-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖）的锥形管中，包括....

Results

不同功率设置后的温度分布

在温度校准中监测每个单次照射的所有温度发展。根据该数据，得到测定点的最高温度，定义为T _max （℃）。 如图3A所示，在将培养皿放置在加热板上的时间点执行程序。在37℃下保存稳定的培养基温度需要140s的"预热时间1"之后，在8秒的"预热时间2"内除去培养皿的盖子。在"预热时间2"结束时，激光发射自动开始。该曲线是10秒照射的代表性温度进程。在照射期间，温度升高，激光发射后立即升高关闭，温度开始下降。在本研究中将培养皿中心的最高温度定义为T _max （℃）。 T _max与激光功率成比例（ 图3B ）。 图3C显示了跨越培养皿的每个功率的最大温度的分布。分布是钟形的，

Discussion

在讨论温度相关的生物细胞反应时，不仅温度升高，而且温度升高的持续时间也是重要的，因为大多数生化过程都是时间依赖性的。特别是在激光诱导的眼科热疗领域，由于时间范围很短（从几毫秒到几秒），很难用精确的温度控制来研究细胞热效应。因此，期望适用于细胞培养模型的激光照射装置和能够进行严格的温度和时间控制的操作系统。热暴露后细胞反应（如蛋白质表达或分泌）的生物学评估需要对足够数量的受影响细胞进行重复定量评估。如在临床治疗中那样，使用直径几百微米的激光斑点进行研究是一个障碍。单个激光点的定量分析是相当的rdensome。在这项研究中，已经尝试尽可能地满足这些需求。通过使用具有照射控制程序的1.94μm波长连续波ium激光器，可以在短时间内在整个细胞培养物中进行时间温度升高。由于可以通过改变光路来调节温度分布，可以使用该设置进行不同种类的热疗相关实验。

所提出的技术的局限性是在电池的激光照射期间不可能进行同时的温度测量。由于使用热电偶不适合灭菌细胞培养，因此温度校准必须与细胞照射分开进行。考虑到激光功率输出的可能变化，每次激光照射期间的实时温度测量将是理想的，直接评估对应于热剂量。此外，这里使用的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
Dulbecco's 改良鹰's 中 - 高葡萄糖	Sigma-Aldrich	D5796-500ML	使用前添加 （2）-（4）。温暖在 37 °C 使用前进行水浴。
抗生素抗真菌溶液（100 次;）	Sigma-Aldrich	A5955-100ML	含有 10,000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 μ;g 两性霉素 B 1 mL。使用前，在 500 mL 中瓶 （1） 中加入 5.5 mL。
丙酮酸钠 （100 mM）	Sigma-Aldrich	S8636-100ML	使用前在 500 mL 培养基瓶 （1） 中加入 5.5 mL（终浓度：1 mM）
猪血清	Sigma-Aldrich	12736C-500ML	使用前在 500 mL 培养基 （1） 中加入 50 mL（最终浓度：10%）
盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
猪胰腺		胰蛋白酶T4799-25G
乙二胺四乙酸 （EDTA）	Sigma-Aldrich	ED-100G
人 VEGF Quantikine ELISA 试剂盒	研发D 系统	DVE00
Oxiselect 总谷胱甘肽检测试剂盒	Cell Biolabs， Inc	STA-312
凋亡/坏死/健康细胞检测试剂盒	PromoKine	PK-CA707-30018
名称	Company	目录号	Comments
设备
铥激光器	Starmedtec GmbH	原型	0-20 W
365 mm 芯径光纤	激光器组件	CF01493-52
热电偶	Omega Engineering Inc	HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
加热板	MEDAX
酶标仪 （荧光分光光度计）	Molecular Device	Spectramax M4
细胞匀浆仪	QIAGEN	TissueLyser LT
荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ti
数学软件程序	The Mathworks。包括	MATLAB Release 2015b
系统设计平台	National Instrument	Labview	Laboratory 虚拟仪器工程工作台