我们提出了设计合成“化学转导剂”的指南，这类转导剂能够诱导原本不相关的天然蛋白质之间产生相互作用。此外，还提供了合成和测试一种特定“转导剂”的详细实验方案，该转导剂可使生长因子激活一种解毒酶，从而调控抗癌前体药物的裂解过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
信号转导通路通过信号蛋白的功能介导，调控细胞对各种环境信号的响应，这些信号蛋白相互作用并以高度特异性激活彼此。因此，模拟这些蛋白功能的合成试剂可能被用于产生非天然的信号转导步骤，从而改变细胞功能。本文提供了设计“化学转导剂”的指导原则，这类转导剂可诱导天然蛋白之间的非天然通讯。此外，还提供了合成和测试一种特定“转导剂”的详细实验方案，该转导剂能够诱导两种无关联的蛋白——血小板源性生长因子（PDGF）与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）——之间的通讯。本文也阐述了如何利用这种非天然的PDGF-GST通讯来控制抗癌前药的裂解，表明此类系统在“人工信号转导治疗”中的应用潜力。本研究旨在促进开发更多此类“转导剂”，用于介导细胞内蛋白质-蛋白质通讯，进而诱导人工细胞信号通路的形成。
引言
信号转导通路在几乎所有细胞过程中都发挥着重要作用，使细胞能够快速响应外界环境信号。1 这些通路通常由信号分子与细胞外受体结合而启动，进而激活细胞内酶类。细胞内信号的放大与传递依赖于信号蛋白的功能，这些蛋白通过形成蛋白质-蛋白质相互作用网络，以高度特异性可逆地激活酶类。由于这些网络的失调常常导致癌症的发生，因此人们高度关注建立“癌症信号转导治疗”策略2，即设计药物以破坏异常的信号转导通路。我们最近提出了一种替代性的信号转导治疗策略，该策略依赖于药物诱导产生非天然信号转导通路的能力。3 具体而言，我们认为通过设计模拟信号蛋白功能的合成分子，有可能间接调控细胞功能。例如，这些人工构建的网络可使蛋白质生物标志物激活能够切割前药的酶类。此外，这些信号蛋白模拟物还可能激活非天然的细胞信号通路，从而产生治疗效果。
为了验证该方法的可行性，我们近期设计了一种合成的“化学转导器”4，该转导器可使血小板源性生长因子（PDGF）通过激活谷胱甘肽-S-转移酶（GST）来触发抗癌前药的裂解，而GST并非其天然结合靶标。该“转导器”的结构包含一个抗PDGF的DNA适配体，并通过修饰连接了一个二价的GST抑制剂。因此，这种合成分子属于一类具有不同蛋白质结合位点的分子家族5-7，例如化学诱导二聚剂（CIDs）8-10，同时也归属于基于寡核苷酸-合成分子偶联物的蛋白质结合剂类别<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. “化学换能器”的合成
- 初步准备
- 通过将278 ml三乙胺与114 ml乙酸及400 ml超纯水混合，配制2 M三乙基乙酸铵（TEAA）缓冲液。调节pH至7，并加水定容至1 L。储存于避光瓶中。
注意：该溶液可稳定保存数年。 - 将18 mg抗坏血酸溶于20 ml超纯水中，配制5 mM抗坏血酸溶液。使用新鲜配制的溶液；该溶液在一天内稳定。
- 将25 mg五水合硫酸铜溶于10 ml超纯水中，另将58 mg三(苄基三唑基甲基)胺（TBTA）溶于11 ml二甲基亚砜（DMSO）中，分别配制溶液后混合，得到10 mM Cu(II)/Tris(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) 溶液。室温保存并避光。
- 通过将278 ml三乙胺与114 ml乙酸及400 ml超纯水混合，配制2 M三乙基乙酸铵（TEAA）缓冲液。调节pH至7，并加水定容至1 L。储存于避光瓶中。
- 偶联步骤
- 将100 nmol修饰寡核苷酸（ODN-1）溶于80 µl新鲜超纯水中。加入20 µl 2 M TEAA（pH = 7），再加入80 µl新配制的抗坏血酸溶液（5 mM水溶液）。
- 将1.5 µmol（574.5 µg）叠氮修饰的依他尼酸溶于180 µl DMSO中，加入上述溶液。用氩气脱气60秒，迅速加入40 µl Cu(II)/TBTA溶液（10 mM，溶于55% (v/v) DMSO/水）。
- 再次通入氩气，密封后室温下搅拌过夜。
- 通过反相高效液相色谱（RP....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
一种“化学换能器”的设计、合成及其诱导PDGF与GST之间人工通讯的作用机制如图2所示。该“换能器”的结构整合了一个PDGF DNA适配体和一个双乙炔酸酰胺（bEA），后者是一种已知的GST抑制剂（图2a）19。这些结合元件使“换能器”能够以不同的亲和力分别结合PDGF和GST，其解离常数（kd）分别为26 nM和144 nM4。此外，根据该设计，当“换能器”结合PDGF后，bEA单元会与PDGF表面发生非特异性相互作用，从而显著降低bEA抑制剂的活性19,22,23。图2b展示了该系统的工作机制。当将“换能器”加入具有活性的GST中时，两个EA单元会同时结合该二聚体酶的两个活性位点，从而抑制其活性。然而，在存在PDGF的情况下，会形成PDGF-“换能器”复合物，阻止bEA单元对GST的抑制作用。这将导致GST-“换能器”复合物解离，从而使GST重新激活。随后，通过加入未经修饰的PDG.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们提出了一种设计和测试“化学转导器”的方法，该转导器可在不修饰天然蛋白质的情况下，诱导两种天然不相关的蛋白质（GST 和 PDGF）之间的人工通信。通过使用酶学检测方法，可实时检测这种非天然的 GST-PDGF 通信；该方法通过监测在“化学转导器”存在下，随着 PDGF 浓度增加时 GST 活性的变化来实现检测。除了检测 PDGF 对 GST 的激活作用外，这些检测方法还可用于追踪竞争性适配体对 GST 的去活化作用，以及 PDGF 介导的抗癌前药的裂解过程。已有文献报道过其他可开关的蛋白质结合剂，它们能够响应寡核苷酸输入来调控蛋白质活性26。然而，本文所述的实验方案展示了一种用于追踪新型蛋白质结合剂功能的方法，这类结合剂可响应天然蛋白质的存在而发挥作用。通过这种方式，可实时检测蛋白生物标志物对酶的调控作用，从而为利用此类系统选择性激活前药及其他 GST 底物开辟了新途径。
需要注意的是，谷胱甘肽S-转移酶（GST）的反应动力学非常迅速，因此，为了从该酶学检测中获得可靠的结果，必须尽量缩短底物添加与开始测量之间的时间。此外，由于酶或底物浓度的微小变化都可能对.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由明娜瓦基金会、人类前沿科学计划组织以及欧洲研究理事会资助（启动资助 338265）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-氯-2,4-二硝基苯 | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| 乙酸 | 生物实验室 | 01070521 | |
| 乙腈 | J.T.Baker | 9017-03 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| 五水合硫酸铜(II) | 默克-密理博 | 102790 | |
| 二甲基亚砜 | 默克-密理博 | 802912 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | 生物工业公司 | 02-023-5A | |
| 依他尼酸 | 东京化成工业株式会社 | E0526 | |
| 谷胱甘肽-S-转移酶 M1-1 | 以色列结构蛋白质组学中心（以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所） | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| 还原型L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| 氯化镁 | J.T.Baker | 0162 | |
| 硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒 | Cayman Chemical | 780001 | |
| 寡核苷酸 | 耶鲁大学W. M. 凯克基金会生物技术中心 | 定制订单 | |
| PDGF-BB | 以色列结构蛋白质组学中心（以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所） | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| 三乙胺 | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| 脱盐柱 | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 柱 | |
| 高效液相色谱 | Waters | 2695 分离模块 | |
| 高效液相色谱柱 | 沃特斯 | XBridgeTM OST C18 色谱柱（2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm | |
| 高效液相色谱柱 | 沃特斯 | XBridgeTM OST C18 色谱柱（2.5 μM，10 mm × 50 mm | |
| 酶标仪 | BioTek | synergy H4 混合型 |
参考文献
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
