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方法文章

小鼠淋巴细胞的分离与活化

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⸱

DOI：

10.3791/54596

⸱

2016年10月30日

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

淋巴细胞是适应性免疫应答中的主要效应细胞。本文介绍一种淋巴细胞纯化方案，用于研究目标分子在淋巴细胞活化过程中的生理功能。 体外 和 体内所述实验步骤适用于比较对照组与基因改造淋巴细胞之间的功能能力。

摘要

B细胞和T细胞具有极其多样的抗原受体库，能够针对几乎任何入侵的病原体引发特异性免疫应答1,2可以理解的是，这些复杂的免疫能力由大量参与各种细胞过程的分子所调控，以确保免疫反应在时间和空间上的精确调控3在此，我们描述了一种利用磁性细胞分选技术快速分离高纯度小鼠淋巴细胞的实验方法。所获得的高纯度淋巴细胞可进一步用于多种实验分析 体外 或 体内 功能检测，例如通过免疫印迹法检测淋巴细胞受刺激后的信号传导能力4 通过增殖能力的检测 3H-胸苷掺入或羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记5-7除了比较对照组与基因修饰淋巴细胞的功能能力外，我们还可以测定抗原提呈细胞（APCs）的T细胞刺激能力。 体内如我们使用移植的CFSE标记的OT-I T细胞所得的代表性结果所示。

引言

成熟的淋巴细胞在个体无既往感染或炎症的情况下通常处于静息状态。因此，在进行后续实验前，分离过程中保持淋巴细胞的初始状态至关重要。 体外 或 体内 功能检测。确保结果一致且可重复的关键在于尽量减少对细胞的不必要操作。

磁性细胞分选利用抗体和微珠标记细胞，从而富集目标细胞群体。该方法包含两种纯化策略：阳性富集和阴性耗竭。阳性富集使用可结合目标细胞的抗体来富集目标细胞群体；而阴性耗竭则是去除非目标细胞，从而保留目标细胞群体。在我们的实验室中，相比阳性富集，我们更倾向于采用阴性耗竭，因为抗体与目标细胞的结合可能会改变细胞的特性与行为。事实上，许多用于分离特定细胞群体的已确立的细胞表面标志物同时也是具有功能的受体。

磁性细胞分选不仅能获得高纯度的活性目标细胞群体，而且耗时更短，并避免了荧光激活细胞分选（FACS）中高压液流所引起的细胞应激。通过标记不需要的细胞群体并利用磁性分离柱将其去除，我们能够快速分离细胞，同时不损害目标细胞群体的活性。在本实验方案中，我们将演示如何采用阴性去除策略来纯化初始B细胞或T细胞。

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方案

所有小鼠均在特定无病原体条件下饲养和维持，所有小鼠实验方案均依照机构动物护理和使用委员会的指南进行。

1. 缓冲液和试剂的制备

  1. 配制完全的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）培养基（含10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/ml）/链霉素（100 µg/ml）、55 µM 2-巯基乙醇）。
  2. 分别配制20倍浓度的平衡盐溶液（BSS）储备液1和储备液2。
    1. 配制20× BSS储备液1（111 mM葡萄糖、8.8 mM磷酸钾、26.7 mM磷酸氢二钠溶于1 L无菌水中），在定容前向其中加入40 ml 0.5%酚红溶液。使用0.2 µm滤膜过滤除菌后，于4 °C保存。
    2. 配制20× BSS储备液2（25.8 mM二水氯化钙、107 mM氯化钾、2.73 M氯化钠、19.6 mM六水氯化镁、16.6 mM硫酸镁溶于1 L无菌水中）。使用0.2 µm滤膜过滤除菌后，于4 °C保存。
    3. 为配制实验用1× BSS，分别将50 ml BSS储备液1和50 ml BSS储备液2各自加入400 ml无菌水中稀释。将两种稀释液混合后调节pH至7，加入20 ml FBS（终浓度2%），再用无菌水补至1 L总体积，并使用0.2 µm滤膜过滤除菌。
      注意：BSS储备液应分别配制，因为高浓度的BSS储备液直接混合可能导致沉淀产生。
  3. 红细胞（RBC）裂解缓冲液
    1. 使用前，将9份氯化铵储备液（155 mM氯化铵溶于无菌水中）与1份Tris碱储备液（130 mM三（羟甲基）氨基甲烷溶于无菌水中，pH 7.65）混合，以配制红细胞裂解缓冲液。
      注意：氯化铵和Tris碱的无菌储备液应于4 °C保存。裂解缓冲液需现用现配，以确保对红细胞的有效裂解。

2. 从脾脏或淋巴结制备淋巴细胞悬液

注意：在小鼠安乐死后，应尽快制备实验所需的所有试剂和设备，并尽快制备淋巴细胞的单细胞悬液，以保持较高的细胞活力。

  1. 通过颈椎脱位或 CO2 窒息法处死实验小鼠。
    注意：从本步骤开始，所有实验操作均应无菌进行。
  2. 在进行任何切口前，将整只小鼠浸入 70% 乙醇中。无菌取出脾脏和淋巴结8，并分别置于含有 5 ml 冰冷 RPMI/FBS（含 2% FBS 的 RPMI）或 BSS/FBS（见步骤 1.2.3）的 15 ml 离心管中。
    注意：由于 BSS 会抑制红细胞有效裂解，因此制备脾细胞悬液时应使用 RPMI，并在红细胞裂解后切换至 BSS。
  3. 为从脾脏或淋巴结制备单细胞悬液，将器官置于培养皿中两片无菌 100 µm 细胞筛网之间，加入 2 ml 冰冷 RPMI/FBS 或 BSS/FBS。使用 1 ml 注射器的推杆碾压器官，直至其被撕裂成极细小的碎片。
  4. 将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，并用冰冷 RPMI/FBS 或 BSS/FBS 冲洗细胞筛网。收集残留的细胞悬液并加入同一 15 ml 离心管中，在 4 °C 下以 453 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    注意：在后续步骤中加入红细胞裂解缓冲液或培养基前，应轻弹管壁使细胞沉淀充分重悬。
  5. 在细胞悬液离心过程中配制室温（RT）红细胞裂解缓冲液（见步骤 1.3）。细胞沉淀形成并去除上清液后，每 108 个细胞加入 1 ml 红细胞裂解缓冲液，重悬细胞。将裂解反应在室温下孵育 3–4 分钟。
  6. 加入 14 ml 冰冷 BSS/FBS 终止红细胞裂解反应，并在 4 °C 下以 453 × g 离心 5 分钟。

3. B 细胞和 T 细胞的纯化

  1. B细胞纯化
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将最多108个脾细胞重悬于300 µl BSS/FBS中，并加入50 µl抗CD43磁性微珠9,10。为去除死细胞，加入30 µl Annexin V磁性微珠。将细胞悬液置于4 °C冰箱中孵育30分钟。
  2. T细胞纯化
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将最多108个细胞重悬于200 µl BSS/FBS中，其中含有非T细胞去除抗体混合物（针对CD19、B220、Gr-1、TCR-γδ、CD49b、CD11c、CD11b、Ter119以及根据目标细胞群选择的CD4或CD8的生物素化抗体），抗体稀释比例为1:2004,5。将细胞悬液置于4 °C冰箱中孵育15分钟。
    2. 孵育后，加入10 ml BSS/FBS洗涤细胞，并在4 °C下以453 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于165 µl BSS/FBS中，加入30 µl链霉亲和素微珠和15 µl Annexin V磁性微珠。将细胞悬液置于4 °C冰箱中孵育30分钟。
      注意：为确保磁性微珠标记均匀，在步骤3.1.1或3.2.2中，先将细胞与微珠孵育15分钟，然后轻轻敲击15 ml离心管混匀，再继续孵育15分钟。
  3. 细胞纯化用分离柱的准备
    1. 在细胞与微珠标记过程中（步骤3.1.1或3.2.2），准备一个未使用过的分离柱。将不含FBS的BSS预热至室温，用2 ml无菌操作洗涤并平衡分离柱。平衡后，已洗涤的分离柱不得干燥。
      注意：由于LS柱可重复使用（见步骤3.4），我们选用LS柱而非推荐的LD柱。
    2. 磁珠标记完成后，加入14 ml BSS/FBS洗涤细胞，并在4 °C下以453 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1–3 ml室温BSS中。
    3. 在分离柱出口端连接一根无菌21 G针头，以降低纯化过程中的流速。将细胞悬液加载至已平衡的分离柱上，收集流出液，其中含有纯化的目标细胞。
      注意：加样时避免将气泡引入分离柱。
    4. 用1 ml BSS/FBS洗涤分离柱一次，收集流出液（含纯化的目标细胞）。将流出液再次加载至分离柱，第二次加载后的流出液收集至同一15 ml离心管中。
    5. 用1 ml BSS/FBS洗涤分离柱3次，每次均收集流出液（含纯化的目标细胞）。随后向分离柱中加入5 ml BSS/FBS，使用推杆将磁性标记的细胞从柱中洗脱至新的15 ml离心管中。
    6. 使用可结合纯化B细胞或T细胞表面抗原的抗体，通过流式细胞术检测所收集细胞的纯度4,5。
  4. 分离柱的重复使用
    注意：LS柱最多可重复使用4次，且不影响纯化效率。
    1. 使用推杆从柱顶部依次用5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，再用5 ml蒸馏水洗涤3次。
    2. 用5 ml 70%乙醇洗涤分离柱，并使用气流充分干燥，以防止柱内生锈。
    3. 为将已使用过的LS柱用于另一次纯化实验，先使用注射器接头从柱底部向上用5 ml 70%乙醇洗涤一次，再从底部向上用5 ml无菌PBS洗涤两次，随后从柱顶部加入5 ml PBS洗涤一次。加入2 ml室温BSS以平衡分离柱，然后继续加载标记后的细胞。

4. CFSE 标记与刺激

注意：纯化的细胞可进行多种 体外 和 体内 功能检测。在此，我们使用纯化的T细胞来确定抗原提呈细胞（APCs）对T细胞的刺激能力5.

  1. 将标记溶液（含0.1% FBS的PBS）在CFSE染色前预热至37 °C。
    注意：在 PBS 中使用低浓度 FBS 可减少 CFSE 负载过程中的细胞死亡，并降低离心过程中的细胞丢失。然而，FBS 浓度过高会干扰 CFSE 的负载。
  2. 用标记缓冲液将纯化的细胞洗涤两次，然后重悬于 2 x 107 在15 ml离心管中，用预热的标记溶液重悬至细胞密度为 cells/ml。
  3. 在预热的标记溶液中配制10 µM CFSE溶液（将5 mM CFSE储备液按1:500稀释）。每次均应新鲜配制CFSE溶液，以获得最佳标记效果。
  4. 将细胞悬液与10 µM CFSE溶液按1:1体积比加入15 ml离心管中，混匀后于37 °C避光孵育10分钟。最终使用5 µM CFSE对1 x 10⁶细胞进行标记。7 细胞/毫升
  5. 每2分钟倒置试管一次，以确保CFSE染色过程中细胞混合均匀。
  6. 为终止反应，加入数倍体积的冰冻完全RPMI培养基，在4 °C下以453 x g离心5分钟。若CFSE成功加载，细胞沉淀将呈淡黄色。
  7. 用预冷的完全RPMI培养基将CFSE标记的细胞再洗涤一次，4 °C下以453 × g离心5分钟，随后用于后续实验 体外 培养或 体内 刺激

5. 体外 刺激

  1. 使用前立即配制刺激物的2倍储存液（2x刺激物储存液），以便将100 µl的2x刺激物储存液加入100 µl细胞中，使每孔终体积为200 µl，适用于96孔板。
  2. 若需要包被有刺激物（B细胞使用IgM或CD40，T细胞使用CD3和CD28）的培养板，应将刺激物用PBS稀释，并在4 °C下过夜包被培养板。或者，可在实验当天于37 °C下包被1小时。包被后用PBS洗涤板两次（切勿使板干燥）。
用于 B 细胞 
刺激物 终浓度
F(ab’)2 山羊抗小鼠 IgM0.6–2.4 µg/ml
抗小鼠 CD40 单克隆抗体0.5–2 µg/ml
重组小鼠 IL-425 U/ml 
脂多糖0.1–10 µg/ml
（LPS）来自 E. coli 血清型 055:B5
用于 T 细胞 
刺激物 终浓度
抗 CD3（包被于平板）2–10 µg/ml
（包被时每孔 50 µl）
抗 CD28（包被于平板） 2 µg/ml
重组 IL-240 U/ml
PDBu（佛波酯）5–50 ng/ml
A23187（钙离子载体）250 ng/ml

表1：用于刺激淋巴细胞的刺激物浓度 体外 培养。

  1. 对于CFSE标记的B细胞，用完全RPMI培养基重悬至3 × 106 个细胞/ml，每孔3 × 105 个细胞接种于96孔平底培养板中，三复孔培养72小时。
  2. 对于CFSE标记的T细胞，用完全RPMI培养基重悬至0.5–3 × 106 个细胞/ml，每孔0.5–3 × 105 个细胞接种于96孔圆底培养板中，三复孔培养48或72小时。

6. 体内 刺激

  1. 对于 体内 刺激后，过继转移 4 x 106 每只小鼠经尾静脉注射200 µl PBS缓冲液中含有CFSE标记的T细胞，注入至MHC匹配的受体小鼠体内。
    注意：在本实验方案中，可采用尾静脉或眶后注射的方式过继转移CFSE标记的T细胞，因为这些细胞会归巢至脾脏和淋巴结等淋巴器官。
  2. 一天后用抗原攻击受体小鼠。
    注意：本示例中使用卵清蛋白（OVA蛋白，每只小鼠50 µg）作为抗原，原因是已将OVA特异性的T细胞受体（TCR）转基因T细胞过继转移至受体小鼠。将OVA蛋白用无菌PBS配制，通过皮下注射（s.i.）方式，每只受体小鼠注射100 µl OVA蛋白/PBS溶液或PBS对照。5.
  3. 在用OVA蛋白或PBS免疫后第3天，收获受体小鼠的淋巴器官（淋巴结和脾脏）并制备单细胞悬液。将淋巴结分为近端淋巴结（pLN，包括腋窝淋巴结、臂淋巴结和浅表颈淋巴结）和远端淋巴结（dLN，包括肠系膜淋巴结、腘淋巴结、腹股沟淋巴结、腰部淋巴结和尾部淋巴结）。使用适当的FACS抗体对细胞进行染色，以检测T细胞增殖。
    注意：在此CFSE细胞示踪实验中，来自PBS注射对照小鼠的CFSE标记T细胞提供了未分裂细胞的基础荧光强度。通过检测荧光峰，可观察增殖性抗原刺激的CFSE标记细胞的细胞分裂情况。12,13通过PBS对照，可以确定增殖的CFSE标记T细胞的分裂次数12,13.
  4. 通过比较样品间细胞分裂次数或峰的数量，分析CFSE标记的细胞增殖数据（图1 和 2).
    注意：例如，将CFSE标记的、OVA特异性T细胞过继转移至接受OVA抗原的受体小鼠后，与注射PBS的对照小鼠相比，这些T细胞将发生显著增殖5,12此外，值得注意的是，CFSE细胞增殖数据有多种分析方法，Hawkins 及其同事已对此进行了展示。14.

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结果

磁性细胞分选法纯化淋巴细胞可使用户在相对较短的时间内纯化目标细胞群体。采用我们的去除非目标细胞方案，可将重组激活基因-1（RAG-1）缺陷型小鼠中OT-I CD8 T细胞的比例从纯化前的72.8%提升至纯化后的94.2%； 图1A)4,5这些纯化的淋巴细胞随后可用于下游功能检测，以评估淋巴细胞增殖和信号转导。4,5例如，我们可以研究 体内 APC的T细胞刺激能力 通过将CFSE标记的抗原特异性T细胞转移至经适当抗原免疫的野生型（WT）和突变型（MT）小鼠体内5.

在我们的代表性实验中，我们将纯化后用CFSE标记的、针对卵清蛋白（OVA）的OT-I CD8 T细胞转移至对照组（WT）和突变组（MT）小鼠体内，并于一天后用OVA蛋白对这些小鼠进行免疫。免疫后第三天，我们收集了淋巴结（近端和远端）及脾脏，并通过流式细胞术...

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讨论

在本实验方案中，我们展示了一种从淋巴器官中纯化淋巴细胞的步骤。利用磁珠分选技术进行细胞纯化是一种快速且简便的方法，可获得具有活性且高度纯化的目标细胞。

方案中的关键步骤

细胞活力和细胞得率

维持造血系细胞的活性 体外 对于确保实验的成功性和可重复性至关重要。化学与生物试剂、次优的实验条件或离体器官的不当保存条件均可能影响细胞活力。从小鼠体内取出淋巴器官后，应立即置于冰上保存，并尽快制备单细胞悬液。应避免对细胞悬液进行高速离心。此外，在移除上清液后，应通过手指轻弹管壁使细胞沉淀松散。不建议直接使用大量培养基并通过移液器强行重悬细胞沉淀。

一只8至10周龄的野生型小鼠可分离出约2-4 × 107个脾脏B细胞以及来自所有主要淋巴结的2 × 107个T细胞。如前所述，若纯化的B细胞和T细胞数量减少（低于预期值），则表明分离条件不理想。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由新加坡教育部（AcRF Tier1-RG40/13 和 Tier2-MOE2013-T2-2-038）资助。稿件由 Obrizus Communications 的 Amy Sullivan 编辑。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
RPMI 1640（不含L-谷氨酰胺）Gibco31870025
胎牛血清使用前需热灭活 
L-谷氨酰胺Gibco25030024
青霉素/链霉素Gibco15140114
2-巯基乙醇Gibco21985023
抗CD43磁珠Miltenyi Biotec130-049-801使用前充分混匀
链霉亲和素磁珠Miltenyi Biotec130-048-101使用前充分混匀
抗Annexin V磁珠Miltenyi Biotec130-090-201使用前充分混匀
MACS LD Miltenyi Biotec130-042-901
96孔U型底无菌培养板Greiner Bio-one650180
96孔F型底无菌培养板Greiner Bio-one655180
100 μm 细胞筛网使用前需用紫外光灭菌
0.2 μm  无菌一次性滤器Nalgene567-0020可用任何无菌滤膜装置替代
CellTrace VioletInvitrogenC34557简称CTV；CFSE的替代染料
CellTrace YellowInvitrogenC34567简称CTY；CFSE的替代染料
CellTrace Far RedInvitrogenC34564简称CTFR；CFSE的替代染料
Cell Proliferation Dye eFluor 670eBioscience65-0840简称CPD670；CFSE的替代染料
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26，CFSE的替代染料
名称公司货号备注
化学试剂
葡萄糖Sigma AldrichG7021
磷酸二氢钾Sigma AldrichP5655
磷酸氢二钠Sigma AldrichS5136
酚红Sigma AldrichP0290
二水合氯化钙Sigma AldrichC7902
氯化钾Sigma AldrichP5405
氯化钠Merck MilliporeS7653可使用其他来源产品
六水合氯化镁Sigma AldrichM2393
硫酸镁Sigma AldrichM2643
氯化铵Sigma AldrichA9434
Tris碱
二甲基亚砜Sigma Aldrich D8418
5-(和6-)羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）Molecular ProbesC-1157用DMSO溶解重悬
佛波醇12,13-二丁酸酯（PBDU，佛波酯）Sigma AldrichP1269
A23187（钙离子载体）Sigma AldrichC7522
名称公司货号备注
抗体与重组蛋白
CD11b生物素标记抗体（克隆号m1/70）Biolegend101204T细胞去除混合液组分
CD11c生物素标记抗体（克隆号N418）Biolegend117304T细胞去除混合液组分
Gr-1生物素标记抗体（克隆号RB6-8C5）Biolegend108404T细胞去除混合液组分
Ter119生物素标记抗体（克隆号Ter119）Biolegend116204T细胞去除混合液组分
TCR-γδ生物素标记抗体（克隆号GL-3）Biolegend118103T细胞去除混合液组分
CD19生物素标记抗体（克隆号6D5）Biolegend115504T细胞去除混合液组分
B220生物素标记抗体（克隆号RA3-6B2）Biolegend103204T细胞去除混合液组分
CD49b生物素标记抗体（克隆号DX5）Biolegend108904T细胞去除混合液组分
CD4生物素标记抗体（克隆号GK1.5）Biolegend100404T细胞去除混合液组分
CD8生物素标记抗体（克隆号53-6.7）Biolegend100704T细胞去除混合液组分
F(ab’)2山羊抗小鼠IgM抗体（包被用）Jackson ImmunoResearch 115-006-075包被时每孔50 µl（96孔板）
抗小鼠CD40单克隆抗体（包被用）Pharmingen 553722包被时每孔50 µl（96孔板）
重组IL-4ProSpec Cyt-282
大肠杆菌血清型055:B5来源的LPSSigma AldrichL-4005
抗CD3抗体（克隆号OKT3）（包被用）eBioscience 16-0037-85包被时每孔50 µl（96孔板）
抗CD28抗体（克隆号37.51）（包被用）eBioscience 16-0281-85包被时每孔50 µl（96孔板）
重组IL-2ProSpecCyt-370
鸡卵清白蛋白（Ovalbumin）Sigma AldrichA7641

参考文献

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