Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Summary

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Abstract

Os pacientes com um número limitado de metástases hepáticas e taxas lentas de progressão podem ser tratadas com sucesso com o tratamento local se aproxima ^{de 1,2.} No entanto, pouco se sabe sobre a heterogeneidade das metástases do fígado, e modelos animais capazes de avaliar o desenvolvimento de colónias metastáticas individuais são necessários. Aqui, apresentamos um modelo avançado de metástases hepáticas que fornece a capacidade de visualizar quantitativamente o desenvolvimento de clones tumorais individuais no fígado e estimar sua cinética de crescimento e eficiência de colonização. Geramos um painel de derivados monoclonais de células de câncer colorretal humano HCT116 estavelmente marcadas com luciferase e tdTomato e possuindo diferentes propriedades de crescimento. Com a injecção do baço seguido de uma esplenectomia, a maioria destes clones são capazes de gerar metástases hepáticas, mas com diferentes frequências de colonização e taxas de crescimento diferentes. Usando o Syste In vivo de imagensm (IVIS), é possível visualizar e quantificar o desenvolvimento de metástase com luminescente in vivo e ex vivo imagiologia fluorescente. Além disso, difusa luminescentes tomografia (DLIT) proporciona uma distribuição 3D de metástases do fígado in vivo. Ex vivo imagem fluorescente de fígados colhidos fornece medições quantitativas de colónias metastáticas hepáticas individuais, permitindo a avaliação da frequência de colonização do fígado e as cinéticas de crescimento de metástases. Uma vez que o modelo é semelhante a metástases hepáticas clinicamente observados, pode servir como uma modalidade para a detecção de genes associados com a metástase do fígado e para testar potenciais tratamentos ablativos ou adjuvantes para a doença metastática fígado.

Introduction

Os pacientes com metástases do fígado a partir de cancros colorectais primários (CRC) são caracterizados por um mau prognóstico. A taxa de sobrevida em 5 anos para primários não-metastáticos CRC (fases I – III) é estimado como 75 – 88% ^3,4, enquanto os pacientes com metástases hepáticas (estágio IV) têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 8 – 12% ^{5 , 6.} No entanto, os doentes metastáticos representam um grupo heterogêneo, apresentando-se com diferentes números de metástases e diferentes tempos de recorrência. As observações clinicas indicam que o número de metástases (o qual pode ser proporcional à capacidade de colonização ou frequência de colonização) e o tamanho de uma única metástase (proporcional à taxa de crescimento local) constituem factores de risco independentes, ^1,7. Em outras palavras, o sucesso de clones que colonizam metastáticos do fígado depende de duas propriedades importantes: a sua capacidade de crescer e a sua capacidade para difundir e sobreviver no microambiente do fígado.

O designde modelos clínicos de sucesso com a capacidade de capturar e quantificar as propriedades metastáticas de clones pode melhorar drasticamente a nossa compreensão da biologia do fígado e metástases fornecer uma ferramenta eficaz para o desenho de potenciais abordagens terapêuticas. Todos os modelos de metástase hepática experimental foram previamente relatado ^8,9, mas nenhum deles desde que a capacidade de capturar e descrever as propriedades dos clones metastáticos individuais tanto in vivo e ex vivo quantitativamente.

Aqui, apresentamos um novo modelo, avançado de metástase do fígado que inclui a geração de clones de tumor com diferentes eficiências de colonização fígado e propriedades de crescimento. Utilizou-se uma combinação de dupla-marcação das células cancerosas com a luciferase e a proteína fluorescente tdTomato com a geração de linhas celulares monoclonais que têm diferenças intrínsecas na capacidade metastática. Neste modelo experimental, os dados indicam que o desenvolvimento demetástases do fígado pode ser descrito em termos de frequência e tempo de duplicação de colonização (Td), o que é consistente com as observações clínicas. A natureza quantitativa deste modelo torna facilmente adotáveis ​​para a descoberta de drogas e fins de diagnóstico.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Chicago (Protocolo # 72213-09) e realizado em condições estéreis. 1. Preparações Adicione 500 mL de meio para a cultura de células tumorais HCT116: Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Autoclave os instrumentos a serem utilizados para o modelo de injecção b…

Representative Results

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo animal consistente e facilmente reproduzível com o potencial para a quantificação de série da carga tumoral metastático in vivo e para a estimativa da frequência de colonização e cinética de crescimento do desenvolvimento de metástases hepáticas. Figuras 2-6, com lendas, são fornecidos a partir de nossa publicação anterior sob uma licença Creative Commons CC-BY 10. <p class="jove_s…

Discussion

O modelo animal apresentado no relatório atual é baseada em duas abordagens principais. Em primeiro lugar, a fim de garantir a capacidade de observar os clones metastáticas com diferentes propensões para colonizar e proliferar no fígado, um painel de linhas celulares monoclonais altamente heterogénea foi estabelecida, ao invés de uma linha de células de cancro não fraccionada estabelecida ^12,13. A abordagem monoclonal para o desenvolvimento de metástase é justificada por dados genômicos recentes <…

Materials

IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter