Summary

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

eklem kıkırdağında Kusur doğal iyileşmek yok. Sonuç olarak, hücre transplantasyonu bozulmuş kıkırdak tamiri için umut verici bir yaklaşım olarak önerilmiştir kaynaklanıyor. Bununla birlikte, bu yöntem, bir kök hücre, yeterli sayıda elde edilmesi ve kondrojenik farklılaşma geçmesi bu hücrelerin uyarılmasını gerektirir. Kemik iliği (BM), yaygın olarak, kök hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak BM hücre izolasyonu, iki önemli dezavantajı vardır: invaziv ve yetersiz verim. Çünkü satın kolaylığı nedeniyle, yağ dokusu, kök hücrelerin tercih edilen kaynağıdır. Daha önceki çalışmalar, adipoz dokusundan kök hücrelerin izole edilmesi ve TGF-ß1 1, 2 gibi sitokinler kullanılarak bu hücrelerde kondrojenik farklılaşmasını uyaran uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Bu yöntemler etkili ama pahalı.

sitokinler için daha düşük bir ekonomik alternatif olarak, mekanik strese kullanılabilirkondrojenik farklılaşmasını indükler. Mekanik yükleme eklem kıkırdağı 3 sağlığını korumada önemli bir rol oynar, ve çeşitli hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olabilir. Örneğin, hidrostatik basınç MAP kinaz / JNK yolunun 4 üzerinden sinovya kaynaklı progenitör hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olur ve mekanik sıkıştırma kondrositik genleri 5 regülasyonunda insan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) 'de kondrojenezi neden olur. Buna ek olarak, kayma gerilmesi insan MSC 6 kondrogenezis ilgili ekstrasellüler matriks (ECM) ifadesi katkıda bulunur. Santrifüj ağırlığı (CG), santrifüj ile üretilen bir kolaylıkla uygulanabilen ve kontrollü mekanik stres, hücre 7 farklı gen ifadesini endükleyebilen. Örneğin, akciğer epitelyal karsinom hücrelerinde, interlökin (IL) -1b sentezlenmesi santrifüj 8 ile üst-düzenlenmektedir. Therefore, deneysel olarak uyanlabilir mekanik stres, CG kök hücrelerdeki kondrositik, gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir. Ancak, CG kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını teşvik edip belirsizliğini koruyor.

Bu çalışmada, CG kondrositik genlerin tanımlanması sonuçlanan insan TSK olarak, SOX9 uyarılması, kondrojenez bir ana regülatör neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, TGF-ß1 olanlar ile kondrojenez CG etkileri, büyüme faktörü en çok kök hücrelerin in vitro kondrojenezi indüklemek için kullanılan göre.

Protocol

Bu çalışma protokolü NIH kurallarına göre Kore Katolik Üniversitesi (KC16EAME0162) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bütün dokular yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir. 1. Santrifüj Yerçekimi Yükleme ve Pelet Kültür Hücre kültürü ve hasat Kültür TSK (P2-P3; Malzemelerin listesine bakınız), 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmi?…

Representative Results

Santrifüj gravite adipoz elde edilen kök hücreleri kondrojenik farklılaşma markerlerinin aşırı ekspresyonunu indükler. kondrojenik değişimi etkilemek için uygun olan, santrifüj yerçekimi kuvveti derecesini belirlemek için, TSK 15 dakika için farklı CG derece (0, 300, 600, 1200 ve 2400 x g) ile uyarıldı. stimülasyon sonrasında TSK kültür plakaları üzerine yeniden ekildi ve 24 saat süre ile kültüre ed…

Discussion

hücrelerin stemness durumu SOX9 CG indüklenen aşırı ekspresyonu için çok önemlidir. Bizim çalışmamızda, SOX9 sentezleme ancak sonraki geçiti TSK, erken geçit TSK (2-3) 'de CG neden olabilir. Yetiştirilmesi sırasında, TSK 3 pasajlar 16 kadar, CD34 + hücreleri içermektedir, bildirilmiştir. TSK hücreleri CG düşük bir yanıt elde geçişli olarak CD34 ifadesini kaybetmek eğilimindedir.

merkezkaç yerçekimi kuvveti ile, hidrostatik basınç CG…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
60mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
Name Company Catalog Number Comments
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Name Company Catalog Number Comments
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50ug/ml
L-proline Sigma Aldrich P5607 50ug/ml
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10ng/ml
Name Company Catalog Number Comments
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody,
 Alexa Fluor 594 conjugate 
Molecular Probe  A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)  Catholic MASTER Cells

References

  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).

Play Video

Cite This Article
Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

View Video