ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה ^-21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון ^1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה.

יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated ^2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר ^3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה ^4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית.

כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות ^5.

ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון ^{6 – 8.} תמ"ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25 חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically ^{6 – 8.} למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות ^9.

<p class = "jove_content"> כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) ^{10 – 12.} בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

Protocol

1. ייצור של 15 N, 13 C-טאו (איור 1) Transform פלסמיד ביטוי T7 רקומביננטי pET15b-טאו 13,14 לתוך BL21 (DE3) תאים חיידקיים המוסמכות coli Escherichia 15. הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך (441 שאריות חומצת אמינו) הוא מש…

Representative Results

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג'ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג'ל…

Discussion

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי ז?…

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4°C
			1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software