从尸检人脑软脑膜捐助外植体培养的推导

Summary

来自人死后大脑的软脑膜外植体培养方案是一种技术上可靠且简单的方法，可在 6-8 周内获得纤连蛋白阳性脑膜成纤维细胞，并冷冻保存约 20-3000 万个细胞。

Abstract

即使很大的进展已在帕金森氏病的临床表征而作出的，一些研究报告，帕金森氏病的诊断没有病理证实在高达临床诊断帕金森氏病的25％。因此，从组织临床确诊患者原发性帕金森病可有误诊率高收取;因此在从这些组织体外研究来研究帕金森氏病作为临床前模型中可以成为徒劳。

通过收集死后人软脑膜与帕金森氏病的一个证实神经病理学诊断和特征在于黑质纹状体细胞损失和细胞内蛋白质的夹杂物称为路易体，人们可以肯定，临床观察帕金森未被另一个潜在的疾病进程（ 例如肿瘤，动脉硬化）引起的。

该协议presenTS解剖，并准备为脑膜成纤维细胞培养的推导死后人类软脑膜的。此过程是健壮和具有高的成功率。培养物的挑战是无菌的脑采购一般不无菌条件下进行。因此，要在培养介质用青霉素，链霉素和两性霉素B的鸡尾酒补充是很重要

脑膜成纤维细胞的尸检确诊病例与帕金森氏症的推导为帕金森氏病的体外模型的基础。脑膜成纤维细胞出现制备样品后3-9天，约20-30亿个细胞可在6-8周冷冻保存。脑膜成纤维细胞培养是同质和细胞表达纤维连接蛋白，一种常用的标记来识别脑膜。

Introduction

脑膜由保护大脑三种细胞膜的:硬脑膜，蛛网膜和软脑膜。最近，已经认识到，脑膜也起到大脑发育和脑稳态¹中起重要作用。脑膜从间充质和神经嵴源性细胞衍生和有趣的是，它已被证明存在于脑膜该祖细胞可以产生的神经元在体外和体内 ^2，3，4移植后。脑膜培养已还成功地用作饲养层，因为它们具有基质细胞衍生诱导活性为胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元^5。此外，软脑膜必须直接分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质缺血条件⁶下的可能性。

此协议，人死后的脑膜样本从蛛网膜和软脑膜收集，统称为软脑膜，并且采购作为人脑捐赠用于研究目的的一部分。大脑的解剖是死亡的24小时之内进行，并且如所示在这里这个协议软脑膜样品置于冷生长培养基用于进一步的处理的下一个6-8小时内。

这个协议描述了用于患者主软脑膜细胞培养的发展解剖和制备的人类脑膜样品。将组织切成25-30片大约3mm×3mm的正方形。三片置于每个6孔明胶包好，并与圆形盖玻片按住。脑膜解剖大约需要25-35分钟。这种....

Protocol

大脑捐献登记包括登记人证明其捐献意图的文件。在法律允许的情况下，组织取回的尸检许可由直系亲属提供。机构审查委员会 （IRB） 审查使用收集的尸检标本的研究，以确保符合健康保险流通与责任法案 （HIPAA） 法规。

注意：软脑膜样本由脑解剖器或神经病理学家在脑解剖过程中收集，并储存在含有 25-30 mL 脑膜生长培养基的 50 mL 锥形管中。将样品储存在 4 °C 直至样品制备。由于细胞的活力会随着死后时间的流逝而降低，因此应尽快进行处理。

1. 开始 Leptomeninges 解剖前的设置

注意：步骤 1.1 - 1.3 将在生物安全柜内进行。

1. 通过在 500 mL 过滤装置中混合 375 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基、100 mL 胎牛血清、5 mL 10 mM 非必需氨基酸、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL 100 mM 丙酮酸钠、5 mL 10,000 U/mL 青霉素/链霉素和 5 mL 250 μg/mL 两性霉素 B 来制备脑膜生长培养基。过滤和混合。使用培养基长达 4 周。
2. 在开始解剖之前，将所有材料放入生物安全柜中：4 个培养皿、2 个 6 孔板、2 个手术刀、15-20 个消毒的 15 毫米盖玻片、磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、血清移液管、吸液管。

Results

当软脑膜处理方案成功时，解剖后 3 到 9 天首先观察到脑膜成纤维细胞的生长，尽管这可能取决于大脑的死后间隔时间长短。图 1 显示了四种不同供体的脑膜成纤维细胞培养物。图 1A 显示了在处理来自 88 岁供体的 88 岁供体后 4 天（死后间隔为 10 小时 20 分钟）后，软脑膜片被玻璃盖玻片（深色对角线）压住和组织周围的成纤维细胞生长。图 1B 显示了 70 岁供体处理后 7 天和死后 11 小时 45 分钟间隔的稀疏成纤维细胞生长。图 1C 显示了 88 岁供体解剖后 13 天和死后 24 小时间隔的成纤维细胞生长。图 1D 显示了传代到 T75 容器中的汇合培养物，并且细胞可以在此阶段冷冻保存。

脑膜成纤维细胞是双极或多极的，具有细长或不规则的形状（图 2）。它们的特征是糖蛋白纤连蛋白和成纤维细胞标志物 SERPINH 的表达，后者位于内质网（图.......

Discussion

该协议描述了一种简单而稳健的协议，用于从与大脑捐赠一起收集的人类死后软脑膜中提取脑膜成纤维细胞培养物。很少有关于从死后人类材料中提取细胞培养物的方案的描述。两项研究描述了皮肤来源的成纤维细胞培养物^7,8,9，一项研究描述了硬脑膜样品¹⁰，另一项研究描述了非冷冻保存的冷冻硬脑膜样品¹¹。

我们准备两个 6 孔板，每个孔中有 2-3 个组织片（约 3 mm x 3 mm），以确保在冷冻保存前充分生长和扩增。至关重要的是，通过轻轻地将无菌玻璃盖玻片压在组织片上以将它们固定到位，将脑膜片附着在培养皿上。如果没有盖玻片，脑膜碎片不会附着在培养皿的底部。只有当组织片与塑料底部直接接触时，才能观察到成功的生长。如果组织片段漂浮在培养基中，则不会观察到组织中的细胞生长。这应该用大约 500 μL 的生长培养基进行，以免.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
康宁培养皿	Fisher Scientific	351029
Nunc 6 孔板	Fisher Scientific	14-832-11
15 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
手术刀，无菌刀片，15 号	Miltex	4-415
弯曲精密尖镊	Fisher Scientific	16-100-122
血清移液管	Fisher Scientific	13-678-11E
巴斯德移液器	Fisher Scientific	22-230490
明胶	Sigma	G1890-100G
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	SH30264.02
康宁 500 mL 过滤装置	Fisher Scientific	430770	结合培养基成分和滤波器。
带过滤盖的 Nunc 细胞培养处理培养瓶， T175 cm2	Thermo Scientific	178883
名称	Company	目录号	评论
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	FisherScientific	SH30910.03
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX 添加剂 （100x）	Thermo Fisher	35050-061
丙酮酸钠 （100 mM）	Thermo Fisher	11360-070
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Thermo Fisher	15140-122
两性霉素 B（黄色溶液/250 &微量;g/mL）	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
名称	Company	目录号	评论
>纤连蛋白染色
8 孔室载玻片	Fisher Scientific	1256518
20% 多聚甲醛	电子显微镜科学	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% 甘油	BioRad	9455
100% 正常山羊血清	Fisher Scientific	101098-382
抗纤连蛋白抗体 [F1]	Abcam	ab32419	在封闭溶液中以 1：300 稀释
抗 SERPINH1	Sigma	S5950-200ul 在	封闭溶液中以 1：250 稀释
抗 SOX2	Millipore	MAB4343	在封闭溶液中以 1：100 稀释
抗巢蛋白	Millipore	MAB5326	：200在封闭溶液中稀释
抗 TUJ1	Covance	MMS-435P	在封闭溶液中以 1：1,000 稀释
Alexa Fluor 488 抗兔	Thermo Fisher	A11029	在封闭溶液中以 1：400 稀释;（绿色通道;激发/EM2 495/519 nm）
Alexa Fluor 555 抗小鼠	Thermo Fisher	A21424	在封闭溶液中以 1：400 稀释;（红色通道;激发/EM2 590/617 nm）
Hoechst 33342 染色	Fisher	H3570	稀释至终浓度为 1.0 &μ;克/毫升;（蓝色通道;Ex/EM2 358/461 nm）
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