利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

摘要

病毒来源的肽段与抗体偶联物（ACs）相结合是一种日益受到关注的方法，因其具有增强分子载荷在肿瘤细胞内蓄积的潜力。本实验方案利用常规方法评估肽段偶联效率、抗体偶联物及其载荷在细胞内的积累情况以及肿瘤靶向性，可为研究人员在关键的早期研发阶段提供支持。

摘要

经病毒衍生肽修饰的抗体偶联物（ACs）是一类具有潜在强大功效的肿瘤细胞递送载体，可用于癌症治疗和成像中的分子载荷递送，其细胞内累积程度较现有的ACs有所提高。在早期AC开发过程中 体外 发育、荧光技术以及放射免疫分析足以确定细胞内定位、蓄积效率和靶细胞特异性。目前，对于评估抗体偶联物（AC）细胞内蓄积和定位的细胞制备方法，尚无标准化的共识。对于经病毒来源肽段修饰的抗体偶联物，若已构建多个候选分子，初始测试尤为关键。通过荧光法测定细胞内蓄积时，细胞表面残留的抗体偶联物可能产生背景信号，干扰对蓄积程度的准确解读。在放射免疫分析中，通常需对处理后的细胞进行分馏，并测量不同细胞组分中的放射活性。然而，细胞裂解效果在不同细胞间存在差异，且细胞核与细胞质组分常无法充分分离，可能导致关于载荷递送特性的数据产生误导。在荷瘤小鼠中静脉注射放射性标记的病毒来源肽段修饰抗体偶联物，随后进行放射性核素成像，是评估肿瘤靶向性和载荷递送特性的有力方法 体内 发育阶段。然而，这一进展相对较新，采用此类方法评估病毒衍生肽修饰的AC的研究团队仍然较少。本文描述了对处理后的细胞进行加工的方法，以便在使用共聚焦显微镜和放射免疫分析时更准确地评估病毒衍生肽修饰的AC的积累情况。具体而言，提供了一种使用胰蛋白酶消化细胞以去除细胞表面结合的AC的方法。同时，本文还提供了一种改进细胞分馏效果的方法。最后，本方案提供了 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）评估荷瘤小鼠中肿瘤初始靶向特性的方法。我们采用放射性同位素 ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 h）作为本方案中的示例载荷。

引言

抗体偶联物（ACs）是一类正在发展成为变革性药物的生物制药产品，可用于改善癌症治疗和肿瘤检测。抗体偶联物由单克隆抗体（mAb）与分子载荷（如放射性同位素、小分子和生物毒素）共价连接而成，能够以极高的靶抗原亲和力和特异性将这些载荷递送至癌细胞。因此，抗体偶联物有望显著降低非特异性毒性，并增强载荷在肿瘤部位的活性。在治疗方面，携带细胞毒性小分子的抗体偶联物（通常称为抗体-药物偶联物）已获批用于治疗接受常规疗法失败的乳腺癌和霍奇金淋巴瘤患者^1,2。此外，携带放射性同位素的抗体偶联物（通常称为放射免疫偶联物）也正处于研发阶段。一种用于成像的携带放射性同位素的抗体偶联物已获批用于识别前列腺癌转移灶³。随着更多治疗性抗体偶联物提交审批⁴，人们对抗体偶联物在未来改善癌症诊疗的前景充满期待⁵。

然而，在递送化疗药物或放射性同位素时，抗体偶联物（ACs）难以有效地将这些载荷在靶细胞内富集。这一局限性在许多情况下显著导致了ACs无法实现持久的无病生存或高对比度的肿瘤成像^6,7。通常情况下，一旦ACs结合其靶抗原，便会通过一....

方案

所述的体内动物实验均根据批准的方案进行，并遵循舍布鲁克大学医疗中心动物实验伦理委员会的伦理准则。

1. 抗体-多肽偶联

注意：ChAcNLS 可在任何商业多肽合成公司或大学附属的多肽合成服务平台进行合成。ChAcNLS 的合成方法见参考文献³⁴。在步骤 1 和步骤 2 中使用单克隆抗体 7G3，该抗体特异性识别白血病抗原 IL-3Rα³⁹。

1. 在1.7 mL微量离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.6）配制浓度为10 mg/mL（总抗体约1 mg）的7G3溶液。
2. 将磺基-SMCC溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为5–10 mM。为确保完全溶解，建议充分涡旋混匀。
3. 向含有7G3的离心管中加入已溶解的磺基-SMCC溶液（通常为5–20 μL，具体体积取决于所需的磺基-SMCC与7G3的摩尔比）。建议测试磺基-SMCC与7G3的摩尔比分别为10:1、25:1和50:1的条件。室温孵育1小时。
4. 使用超滤装置对马来酰亚胺修饰的7G3进行纯化和浓缩，并在PBS（pH 7.0）中进行缓冲液置换。以8,000 × g离心约5分钟。弃去滤过液，重新加入PBS（pH 7.0）后再次离心。
   ....

结果

对于方案1，使用磺基-SMCC作为交联剂对7G3进行ChAcNLS修饰的构建过程非常可靠。通常在加载至12%凝胶并进行SDS-PAGE分析时，可观察到分子量（MW）随所用磺基-SMCC与7G3比例的增加而呈现可区分的逐步升高，从而能够分别评估重链和轻链上的ChAcNLS偶联情况（图3）。7G3 在 10:1、20:1、25:1 和 50:1 的 sulfo-SMCC 与 7G3 摩尔比下反应，随后通过 Rf 测量和分子量外推，结果显示每个 7G3 分子分别偶联了 3、7、10 和 20 个 ChAcNLS 分子。经密度测定法分析，单体物种的百分比为 > 7G3修饰3-10个ChAcNLS时为90%。对于7G3-ChAcNLS₂₀ 聚集体物种占45%。这表明SDS-PAGE是筛选可用于进一步开发的7G3-ChAcNLS偶联物的一种简单而有效的方法。尽管由于抗体糖基化可能导致抗体链出现轻微拖尾，但这并不影响对聚集体物种的鉴定。

讨论

全身递送抗癌药物的主要目标是增加药物在肿瘤部位的富集以及癌细胞内的摄取，同时减少对健康组织的不良副作用。利用抗体偶联物（AC）将分子载荷靶向递送至肿瘤细胞，是一种极具前景的肿瘤治疗与检测方法。然而，由于内体滞留及后续溶酶体降解所导致的疗效降低，仍然是一个重要的挑战。尽管本实验方案以ChAcNLS肽为例说明下一代AC的构建过程，但所描述的操作步骤可适用于任何正在开发的肽修饰AC，旨在提高靶向癌细胞内递送载荷的量。

该方案中最关键的步骤包括：1）识别并限制高分子量聚集体物种；2）在分析前对细胞进行胰蛋白酶消化以测定细胞内蓄积；3）对细胞分馏程序进行质量保证；4）进行PET成像以评估肿瘤靶向性 体内.

病毒源性肽段与单克隆抗体（mAb）偶联时，必须避免形成高分子量的聚集物，此类聚集物极有可能由mAb之间的分子内交联引起。这是首要关注的问题，在进一步实验前应予以解决。若继续使用含有非预期聚集物的肽修饰抗体偶联物（AC），可能导致在细胞内及体内载荷递送特征等方面获得误导性结果。mAb上存在的活性马来酰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磺基-SMCC	Thermo Scientific	22122	可选择多种同双功能或异双功能马来酰亚胺交联剂。
Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器	EMD Millipore	UFC505096	提供 8、24 和 96 的包装规格，可根据需求选择。
Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准蛋白	BioRad	1610375EDU	分子量范围为 10 - 250 kDa 的多色重组蛋白。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Scientific	25200056	可选择 100 mL 或 500 mL 规格。
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647 标记	Thermo Scientific	A-21235	推荐使用浓度为 1 - 10 μg/mL
NOTA-NHS	CheMatech	C100
核纤层蛋白 A/C 抗体（N-18）	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 单克隆抗体	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS 样品缓冲液（4×）	Thermo Scientific	NP0007
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a 细胞	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 培养基	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA 裂解与提取缓冲液	Thermo Scientific	89900
AMIDE 医学影像软件	可在 amide.sourceforge.net 获取		完全免费下载
FluoView FV1000 共聚焦显微镜	Olympus
Fluoview 软件	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC 层析条	Biodex	150-771