레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석
Summary
레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.
Abstract
한 DNA 손상 반응 (DDR)는 광범위 생균 마이크로 레이저 빔 조사에 의해 유도 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)의 연구에있어서되었다. 동독은 interstrand DNA에 크로스 링크 (ICLS)를 포함하여 DNA의 공유 개조를 왜곡하는 나선뿐만 아니라, 정의되지 않는다. 우리는 살아있는 세포의 핵에, immunotagged psoralens의 레이저 photoactivation 현지화 ICLS에 의해 자극 DDR을 공부했다. 부가 배포 및 복제 포크의 만남에 대한 근본적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 두 개의 다른 기술과 레이저 현지화를 결합했다. DNA 섬유는 종종 짧은 펄스 중에 혼입 클레오 사이드 유사체의 면역에 의한 복제 포크의 진행을 표시하기 위해 사용된다. Immunoquantum 점은 널리 단일 분자 이미징을 위해 사용되어왔다. 새로운 방식으로, 레이저 국소 ICLS 운반 세포로부터 DNA 섬유 현미경 슬라이드 상에 확산된다. 태그가 달린 ICLS는 immunoquantum 점 및 일 함께 표시됩니다E 간 거리 병변 결정. ICLS와 복제 포크의 충돌이 가시화 될 수 있으며, 다른 만남 패턴 확인 및 정량.
Introduction
DNA는 또한,도 산화 적 대사에 의해 생성 된 내인성 라디칼 종에 의해 공격 등의 방사선, 자외선, 환경 독소, 연소 생성물과 같은 외래 에이전트로부터 일정한 공격을 받고있다. 이 모든 화학적 또는 물리적으로 DNA 1의 무결성을 방해 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 게놈의 교란은 병변 수리에 관여하는 단백질과 마이크로 RNA하지 않을 경우 수천, 수백와 DNA 손상 응답 (DDR), 모집 및 사후 번역 수정 캐스케이드를 활성화 할 수 있습니다, 세포주기, 세포 사멸, 노화 및 염증 경로의 조절 2.
동독에 대한 우리의 정보의 대부분은 DSBs와 연구에서 비롯됩니다. 이는 3 살아있는 세포 게놈 DNA에서 서열 특이 나누기 포함 나누기를 도입하기위한 기술의 유용성에 큰 부분이다. 또한, propensit중단의 예는 면역에 의해 표시 될 수 DDR 단백질의 초점을 유도하는 단계, 및 반응 속도론 단백질의 요구를 식별하는 매우 유용하고있다. 동독 연구를위한 핵심 기술 중 하나는 살아있는 세포 4의 핵에 '관심 지역'에 DSBs의 스트라이프를 직접 (ROI)을 레이저 빔을 사용 보너와 동료에 의해 소개되었다. 실제로, 그들은 DDR의 단백질이 면역 식별 할 수있는 긴 초점을 만들었습니다. 이것은 레이저 노출 된 세포에서 인산화 된 히스톤 H2AX의 강한 스트라이프 (γ-H2AX) 그들의 증명에 의해 설명되었다. 이후 레이저 DSBs 접근법에 의해 유도되는 DDR의 다양한 연구에 이용되어왔다. 강력하고 인기 극적인 면역 형광 이미지의 소스 있지만,이 병변의 정체성에 대한 걱정없이, 관찰 결과를하기 위해 대부분의 실험에서 레이저 강도를 조절 주목해야한다밀도, 또는 간격. 사실, 이러한 추정을하기 어려울 수 있습니다. 따라서 그들은 주로 레이저 (5)에 의해 DNA에 도입 병변의 다양성에도 불구하고, 무시됩니다. 이 문헌 6에있는 많은 모순에 기여한다.
DSBs는 대조적으로, 대부분의 DNA의 화학적 변형은 DDR 단백질 이산 초점의 형성을 자극하지 않는다. 이 병변 주파수의 우리의 현재 이해의 관점에서 중요하다. 인간 배양 세포는 S 단계 7, 8, 9 중 주로 형성된 세포주기 당 50 개 DSBs을 초래한다는 것이 추정된다. 적은 비 증식 세포에서 형성된다. 이것은 세포 / 1 일, 10 당 수만에있는 핵산 염기 손실 또는 수정 이벤트의 수와 대조를 이룬다. 따라서, 우리는 가장에 대해 알고비교적 드문 및 집계에서 훨씬 더 일반적이다 나선 왜곡 병변에 의해 유도 된 사람들에 대해 많은 작은 사건에 의해 유도 된 DDR.
게놈 DNA의 수정을 공유 결합하는 세포 반응에 대한 질문을 해결하기 위해, 우리는 고유의 DDR 유도 활동을했다 나선 왜곡 DNA 부가 물로 작업하고 싶었다. 또한, 실험 설계를 용이하게하고 해석 우리는 누구의 소개 시간에 대한 제어 및 시각화 의무가 있었다 될 수있는 구조에 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 소 랄렌에 기초한 전략을 개발했다. 현장에서 : Psoralens 잘 5 'TA를 선호 광활성 DNA에 인터 칼을 특징으로한다. 질소 머스타드 및 마이 토마 이신 C (MMC)들은 장파장 UV (UVA) 광에 노출하지 않는 DNA 반응성 아닌 다른 가교제 달리. 인터 분자 나선 왜곡 interstrand 가교 결합을 생성하기 위해 반대 가닥의 티민 염기 (ICLS 반응) 11. 실험에 사용 된 트리메틸 랄렌 대부분의 제품은 형성되어 있지 않은 비교적 적은 monoadducts가 (10 % 미만) 생성 ICLS, 12, 한 가닥에 인접 염기 간의 intrastrand 가교이다. 그들은 시스 백금과 MMC 등의 복제와 전사, 소 랄렌 등의 가교제, 강력한 블록이기 때문에, 일반적으로 화학 요법에 사용됩니다. 따라서 랄렌 나선 구조의 왜곡으로 DDR의 활성화에 따라, 또한 임상 적 중요성이있는 화합물에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공 연구 할 수 있었다.
우리는 트리메틸 랄렌 (파기)를 디곡시 제닌에 링크시킨 시약을 합성 식물성 스테롤은 포유 동물 세포에서 발견 자주 immunotag으로 사용되지. photoactivation 대한 요구는 살아있는 세포의 핵에서 정의 된 ROI에 랄렌 ICLS의 레이저 광 (365 ㎚)으로 현지화를 허용한다. 이들은 IMM를 표시 할 수 있습니다발굴 태그에 대한 unofluorescence. DNA 수리 및 DDR 단백질 ICLS 13, 14 국소 레이저 스트라이프 나타났다.
DSBs을 생산하는 데 사용 높은 레이저 강도에 의해 활성화 된 DDR 절연 또는 클러스터 손상 15, 16 때문일 수 있습니다. 따라서,이 실험 결과의 관련성 자연스럽게 병변 본 훨씬 낮은 농도로 발생하는 불확실하다. DNA의 소 랄렌 부가 주파수 및 간격에 대해 비슷한 질문을 해결하기 위해, 우리는 DNA 섬유 기술 17 immunoquantum 점을 이용했다. 양자점은 형광 염료보다 훨씬 더 밝은 빛에 노출 표백되지 않는다. 따라서 이들은 종종 단일 분자 이미징 (18)에 사용되는, 애플리케이션되는 형광 염료는 충분히 밝다. 개별 DNA 섬유 g에서 신장 될 수있다아가씨 슬라이드는 수확 셀에 앞서 배양 중에 혼입 클레오 사이드 유사체에 대해 면역 형광에 의해 표시 될 수있다. 우리는 땅을 파고 – 소 랄렌과 세포 치료 및 레이저 마이크로 조사에 대한 투자 수익 (ROI)을 노출. 섬유는 immunoquantum 점으로 가시화 될 수있는 셀의 개별 파기 랄렌 – 부가 물로부터 제조되었다. 상대적으로 짧은 시간 (20~60 분)에 대한 뉴 클레오 시드 유사체를 위해 세포를 노출시키는 레이저 국소 ICLS 근방 복제 책자의 표시를 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
레이저 현지화 기술은 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다 핵에 부착 세포의 사용을 필요로한다. 우리는 리신 또는 콜라겐, 또는 더 복잡한 혼합물로서 세포 접착 제제로 유리 표면에, 예컨대 차 림프구 또는 AD293 느슨하게 접착 배양 된 세포와 같은 비 접착 성 세포를 부착하는 것을 시도했다. 이러한 치료는 표면에 세포를 결합 할 수 있지만, 우리는 그들이 일반적으로 매우 어려운 핵에 집중하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 (Z01 AG000746-08)와 판 코니 빈혈 연구 기금을 노화에 국립 보건원, 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
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