Summary

Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио

Published: May 25, 2017
doi:

Summary

Этот протокол описывает гистологические анализы печени у личинок рыбок данио, которые обрабатывались 2% -ным этанолом в течение 24 часов. Такая обработка острым этанолом приводит к стеатозу печени и набуханию печеночной сосудистой сети.

Abstract

Алкогольная болезнь печени (ALD) относится к повреждению печени из-за острого или хронического злоупотребления алкоголем. Это одна из ведущих причин заболеваемости и смертности от алкоголя и затрагивает более 2 миллионов человек в Соединенных Штатах. Лучшее понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе алкогольной травмы печени, имеет решающее значение для разработки эффективного лечения ALD. Личинки данио вызывают печеночный стеатоз и фиброгенез через 24 ч воздействия 2% -ного этанола, что делает их полезными для изучения острого алкогольного поражения печени. В данной работе описывается процедура лечения острым этанолом у личинок рыбок данио и показано, что он вызывает стеатоз и опухание печеночных кровеносных сосудов. Также описан детальный протокол окрашивания гематоксилин-эозином (H & E), который оптимизирован для гистологического анализа личиночной печени рыбок данио. Окрашивание H & E имеет ряд уникальных преимуществ по сравнению с иммунофлуоресценцией, так как оно означает все живоеЭритроциты и внеклеточные компоненты одновременно и могут легко обнаруживать повреждение печени, такое как стеатоз и фиброз. Учитывая увеличение использования данио в моделировании токсина и вызванного вирусом повреждения печени, а также наследственных заболеваний печени, этот протокол служит справочным материалом для гистологического анализа, проведенного во всех этих исследованиях.

Introduction

Алкогольная болезнь печени (ALD), вызванная чрезмерным потреблением алкоголя, является основной причиной заболеваемости и смертности от алкоголизма. В Соединенных Штатах почти половина смертей от заболеваний печени связана с алкоголем 1 , и ALD отвечает за почти 1 из 3 трансплантаций печени 2 . ALD имеет широкий спектр. Стеатоз, который характеризуется избыточным накоплением липидов в гепатоцитах, встречается на ранней стадии интенсивного питья и обратимо при прекращении употребления алкоголя. Под влиянием генетических и экологических факторов и продолжающимся потреблением алкоголя стеатоз печени может прогрессировать до алкогольного гепатита и, в конечном счете, цирроза 3 . Исследования с использованием моделей грызунов ALD обеспечили существенное понимание болезни, но они имеют ограничения (см. Ссылку 3 ). Устное питание от алкогольной диеты вызывает только стеатоз у грызунов 4 , </ Sup> 5 . Развитие воспаления и фиброза требует либо второго инсульта 6 , 7, либо хронического внутрижелудочного вливания, которое является инвазивным и технически сложным 8 , 9 . Телео данио также развивает повреждение печени в ответ на хроническое и острое лечение алкоголизмом 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . В частности, личиночные рыбки данио представляют собой привлекательный дополнительный модельный организм, в котором изучается острая алкогольная травма печени 10 , 11 , 13 , 15 . Печень данио является функциональной и производит ключевые ферменты для метаболизма этанола к 4-му дню(Dpf) 13 , 16 , 17. Этанол может быть непосредственно добавлен в воду, а воздействие на 2% этанола в течение 24 ч является достаточным для индуцирования печеночного стеатоза и фиброгенных реакций у личинок рыбок данио 13,15.

Сообщалось, что обработка 2% этанола в течение 24 ч приводила к концентрации тканевого этанола 80 мМ у личинок рыбок данио 13 . Другие показали, что личинки переносят эту концентрацию, и фенотипы печени, наблюдаемые у обработанных животных, специфичны для воздействия этанола 11 , 13 , 15 , 18 . Тем не менее, поскольку 80 мМ почти смертельно для людей 19 , важно оценить гистологию печени обработанных этанолом рыбок данио и детейRmine физиологическое отношение к людям.

Быстрое внешнее развитие и просвечивание личинок рыбок данио позволяют характеризовать действие алкоголя в печени в режиме реального времени и в фиксированных образцах. Доступность флуоресцентных трансгенных линий, специфичных для клеточного типа, и последние достижения в конфокальной микроскопии облегчают изучение того, как различные типы клеток печени изменяют свою морфологию и поведение в ответ на лечение острым этанолом 11,15. Однако конфокальная визуализация флуоресцентного трансгенного данио не может полностью заменить окрашивание гематоксилин-эозином (H & E) при исследовании гистологии печени. Маркировка всех типов клеток печени одновременно с использованием трансгенных рыбок данио требует генерации отдельных трансгенных линий, каждая из которых маркирует один тип клеток печени уникальным флуорофором. Введение различных трансгенных фоновых условий в одну и ту же рыбу требует разведенияG нескольких поколений, что требует больших затрат времени и затрат. Дополнительное окрашивание иммунофлуоресценции необходимо для обнаружения компонентов внеклеточного матрикса. С другой стороны, окрашивание H & E одновременно маркирует все типы клеток печени и компоненты внеклеточного матрикса, таким образом обеспечивая обзор печени 20 . Более того, он легко обнаруживает несколько гистопатологических признаков заболеваний печени, таких как смерть гепатоцитов, стеатоз и фиброз. Хотя H & E является обычным пятном в гистологии печени млекопитающих, оно обычно не используется в исследованиях печени рыбок данио, а протокол менее хорошо известен.

Эта работа описывает протокол для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и для последующего гистологического анализа с окрашиванием H & E. Протокол окрашивания H & E может использоваться во всех исследованиях развития и функционирования печени. Кроме того, парафиновые срезы могут быть использованы для иммуногистохимии, а также для других специальных исследованийIns в патологии печени, включая пятно трихрома, окрашивание ретитулина и т . Д.

Protocol

AB WT взрослых и личиночных данио были сохранены в стандартных условиях 21 в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальные институты здравоохранения, публикация 86-23, пересмотрен в 1985 году); Их использование было одобрено Инстит?…

Representative Results

10% буферный формалин и 4% параформальдегид (PFA) являются двумя наиболее часто используемыми фиксаторами, используемыми для гистологических методов. Однако они не дают оптимальных результатов фиксации для ткани печени данио ( рис. 1 и табл. 1 ). Фи?…

Discussion

Текущий протокол описывает подробную процедуру для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и последующие гистопатологические анализы с окрашиванием H & E. Острая обработка этанолом должна проводиться не ранее чем через 96 ч после оплодотворения, так как на этой стадии печень ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность д-ру Кэти Мюррей в Международном ресурсном центре Zebrafish; Д-р Стейси Хапперт и Кари Хапперт в CCHMC за их полезные советы по протоколу; И ветеринарная служба CCHMC, для ухода за рыбой. Эта работа была поддержана грантом NIH R00AA020514 и исследовательским грантом от Центра детской геномики в CCHMC (до CY). Кроме того, он частично поддерживался грантом NIH P30 DK078392 (Интегративное морфологическое ядро) Центра сердечно-сосудистых заболеваний в Цинциннати.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

References

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

View Video