从附睾分离的原代上皮细胞的全细胞膜片钳记录

摘要

我们介绍一种结合细胞分离与全细胞膜片钳记录的技术方案，用于测定大鼠附睾尾部原代分离的上皮细胞的电生理特性。该方案可用于研究原代附睾上皮细胞的功能特性，从而进一步阐明附睾的生理作用。

摘要

附睾是精子成熟和生殖健康的重要器官。附睾上皮由多种复杂连接的细胞类型组成，这些细胞不仅在分子和形态特征上各不相同，其生理特性也存在差异。这些差异反映了它们各自多样的功能，共同在附睾管腔内为睾丸后精子发育建立必要的微环境。了解附睾上皮细胞的生物物理特性，对于揭示其在生理及病理生理条件下对精子和生殖健康的作用至关重要。尽管这些细胞的功能特性尚未完全阐明，但可通过膜片钳技术对其进行研究，该技术可用于测量单个细胞的细胞事件及膜特性。本文中，我们描述了细胞分离及全细胞膜片钳记录的方法，用于测定大鼠附睾尾部原代分离上皮细胞的电学特性。

引言

男性生殖道中的附睾是一个由镶嵌状上皮细胞层构成的器官。与其他上皮组织类似，附睾上皮中的多种细胞类型（包括主细胞、亮细胞、基底细胞以及免疫系统和淋巴系统的细胞）协同作用，共同发挥管腔前沿屏障功能，并为精子成熟和生理活动提供支持作用^1,2,3。因此，这些上皮细胞在生殖健康中发挥着至关重要的作用。

上皮细胞通常被认为是非兴奋性细胞，由于缺乏电压门控的Na⁺或Ca²⁺通道，无法对去极化刺激产生“全或无”式的动作电位^4,5。然而，上皮细胞表达一组独特的离子通道和转运蛋白，调控其特化的生理功能，例如分泌和营养物质的转运⁶。因此，不同类型的上皮细胞具有特征性的电生理特性。例如，主细胞表达CFTR以介导液体和氯离子的转运，并表达TRPV6以参与钙的重吸收，而亮细胞则表达质子泵V-ATPase以实现管腔酸化^1,7,8<....

方案

所有动物实验均按照上海科技大学动物实验伦理委员会的指南进行，该委员会的规范符合当地及国际要求。

1. 实验动物

1. 使用8至12周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300-450 g）。在此年龄段，精子已到达附睾尾。

2. 从大鼠尾部附睾中分离上皮细胞

注意：除非另有说明，以下步骤均在非无菌条件下进行。

1. 解剖器械与试剂的准备
   1. 将解剖工具浸入70%乙醇中进行消毒，并使其自然晾干。
   2. 开启恒温水浴（32 °C）；在洁净空气流控制的工作站中，准备并预热500 mL含1%（v/v）抗生素（终浓度为100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）的1×Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI），标记为“RPMI (+P/S 1:100)”。
   3. 准备并预热500 mL含非必需氨基酸（0.1 mM）和丙酮酸钠（1 mM）的1×Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），并添加5-α-二氢睾酮（1 nM）、10%胎牛血清和1%（v/v）抗生素（终浓度为100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），标记为“Full-IMDM”。分装成50 mL等份，用封....

结果

所述从大鼠附睾尾部分离上皮细胞的酶消化方法，是在我们先前研究基础上改进的方案^9,12。该方法获得的单细胞混合物细胞活力超过90%，且无表面泡状结构或细胞肿胀现象。这种异质性细胞混合物主要由主细胞、亮细胞和基底细胞组成，正如我们此前所述¹。在本方案中，通过将原代解离的细胞在培养皿中过夜培养，使非上皮细胞（如成纤维细胞和平滑肌细胞）贴壁，从而获得相对纯净的附睾上皮细胞样本，如图1A（收获前）所示。随后可在显微镜下根据细胞表型初步区分细胞类型，并依据其特异性的被动膜特性进行分类。在解离后的细胞混合物中，有一类细胞在其表面膜的一端具有微绒毛或粗糙膜结构，并呈现细胞内容物的极性分布；这类细胞被称为主细胞或类亮细胞（图1B，箭头所示）。这些极性上皮细胞在形态学特征上难以区分，但可通过全细胞膜片钳记录所获.......

讨论

在本实验方案中，通过酶解法分离大鼠附睾尾 consistently 获得健康的上皮细胞。附睾上皮细胞在膜片钳实验中的质量依赖于该方案中的几个关键步骤。例如，将细胞混合物以较低离心力（30 × g）进行离心，对于去除精子和附睾管腔内容物至关重要；若细胞培养体系中存在精子，附睾上皮细胞的健康状态会受到影响。此外，将解离后的细胞混合物在培养皿中孵育数小时是去除成纤维细胞和平滑肌细胞的重要步骤；非上皮细胞在培养皿表面贴附速度较快，从而使得上皮细胞保留在悬浮液中，可通过轻柔抽吸重新收集。同时，胶原酶消化以及使用细口玻璃移液器进行吹打，是细胞解离过程中获得单个细胞的两个关键步骤。最后，附睾细胞的酶消化程度对膜片钳实验极为关键，因为酶活性不足导致消化不充分，或孵育时间过长导致消化过度，均会破坏移液器与细胞膜之间吉欧姆密封（giga-ohm seal）的形成。

在细胞混合物中，体积较大、呈柱状、细胞膜表面粗糙且一端带有静纤毛、胞内物质呈极性分布的细胞，很可能是主细胞或亮细胞。其他缺乏明显微绒毛和极性分布胞内物质的细胞，可能包括基底细胞以及部分免疫系统来源的细胞。本实验方案除了描述附睾上皮细胞的基本.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AXON 系统仪器
计算机控制放大器	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B 膜片钳放大器
数字采集系统	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 转换器
显微镜	Olympus	BX-61WI
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-325
记录室及在线加热器	Warner Instruments	TC-324C
HEKA 系统仪器
膜片钳放大器	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB 双通道
显微镜	Olympus	IX73
显微操作器	Sutter Instruments	MPC-325
记录室及在线加热器	Warner Instruments	TC-324C
其他仪器
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-1000
记录室	Warner Instruments	RC-26G 或自制记录室
含丝硼硅酸盐毛细管玻璃	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
防振台	TMC	63544
数字相机	HAMAMATSU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
用于细胞分离的试剂
RPMI 1640 培养基	Gibco	22400089
青霉素/链霉素	Gibco	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
胶原酶 I	Sigma	C0130
胶原酶 II	Sigma	C6885
5-α-二氢睾酮	Medchemexpress	HY-A0120
胎牛血清	capricorn	FBS-12A
微电极内液（K⁺ 基溶液）（pH 7.2，280–295 mOsm）
KCl，35 mM	Sigma/各种	V900068
MgCl2 · 6H2O，2 mM	Sigma/各种	M2393
EGTA，0.1 mM	Sigma/各种	E4378
HEPES，10 mM	Sigma/各种	V900477
K-葡萄糖酸盐，100 mM	Sigma/各种	P-1847
Mg-ATP，3 mM	Sigma/各种	A9187
标准细胞外记录生理盐溶液（PSS）（pH 7.4，300–310 mOsm）
NaCl，140 mM	Sigma/各种	V900058
KCl，4.7 mM	Sigma/各种	V900068
CaCl2，2.5 mM	Sigma/各种	V900266
MgCl2 · 6H2O，1.2 mM	Sigma/各种	M2393
NaH2PO4，1.2 mM	Sigma/各种	V900060
HEPES，10 mM	Sigma/各种	V900477
葡萄糖，10 mM	Sigma/各种	V900392
用于 pH 调节
NaOH	Sigma/各种	V900797	纯度 >=97%
KOH	Sigma/各种	60371	纯度 >=99.99%