本方案描述了在切除部分跟腱后，向大鼠注射同种异体富血小板血浆（PRP）或生理盐水后，对其肌腱愈合过程的评估方法。通过多种分析手段，在多个时间点对肌腱愈合的进展情况进行评价。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了用于观察富血小板血浆（PRP）是否能够对肌腱愈合产生积极影响的实验步骤。主要步骤包括四个环节：在跟腱上诱导产生损伤；制备PRP并将其（或生理盐水溶液）注射至损伤部位；取出跟腱；进行生物力学、分子和组织学评估。在每个步骤中，所有操作和方法均被详细描述，以便于实验的重复实施。
跟腱已通过手术切断（切除5毫米长的节段）。随后，注射富血小板血浆（PRP）或生理盐水，以研究PRP是否对跟腱愈合具有促进作用。实验共使用120只动物，分为3组，每组40只，每组再细分为两个亚组：PRP注射组和生理盐水注射对照组。在不同时间点处死动物（A组：5天；B组：15天；C组：30天），并取出跟腱。其中90条跟腱在进行转录组分析前接受生物力学测试，其余30条跟腱进行组织学分析。
引言
血小板在凝血、炎症过程以及免疫调节中的作用已被广泛认知1。近年来的研究进一步表明，血小板还具有修复功能2,3。事实上，血小板在脱颗粒过程中会释放多种细胞因子和生长因子（如VEGF、PDGF、TGF-B、IGF-I和HGF），这些生长因子可促进血管生成、组织重塑以及创伤愈合（包括骨、皮肤、肌肉和肌腱）2。通过离心自体血液可获得富含血小板的血浆（PRP），其血小板浓度因分离方法不同而异（通常为全血基础浓度的3至10倍）。然而，目前各种PRP制备技术尚无法获得完全一致的终产物。迄今为止，国际上对此仍无统一标准。总体而言，PRP可能是一种治疗慢性肌肉骨骼疾病（如肌腱病、足底筋膜炎、骨关节炎和骨不连）的有前景的治疗选择4。PRP最初应用于口腔外科和种植学领域4，以促进种植体植入后骨组织的修复并加速愈合过程。在本研究中，我们描述了一种可重复的方法，用于在动物实验中获取PRP4。
由于肌腱损伤在运动员和体力劳动者中较为常见，因此加快愈合过程以缩短恢复时间具有重要意义5。目前新兴的治疗方法常涉....
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方案
动物的饲养和操作均遵循美国国家科学院编制、美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物的护理和使用指南》，并严格遵守欧洲及国家相关法律法规。
1. 动物准备
- 使用132只体重为320-450 g的2月龄雄性Sprague-Dawley大鼠（120只用于实验，12只用于采血，图1）。根据Dell13的研究，每组15只大鼠即可达到0.8的检验效能（若存在指定效应，有80%的概率发现统计学显著性）。
- 将所有大鼠饲养于传统笼具中，在配备更衣站的普通设施内实施隔离饲养。在独立通风笼具（IVC）架中进行繁殖，并专门采购无特定病原体（SPF）级大鼠。
- 采用以下饲养条件：温度范围19-24 °C；相对湿度：40-60%；通风：每小时换气10-15次；光照/黑暗周期：12小时光照-12小时黑暗。
- 对所有笼具设备进行灭菌处理，并使用辐照垫料。通过在笼内放置无菌纸板托盘和毛巾，系统性实施笼内环境丰富化措施。
- 限制人员进入该区域，进入时须穿戴新的实验服、口罩、手套、鞋套和头帽。
- 根据FELASA14对普通设施的建议，每年对饲养在污染垫料上的哨兵动物进行一次群体健康监测。每笼饲养4至5只动物，提供适当的辐照饲料，并自由供应酸化....
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结果
结果以均值 ± 均值的标准差表示，并采用方差分析（ANOVA）进行比较。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和 事后检验 采用Scheffé检验，这是一种参数检验。
大鼠未损伤跟腱发生断裂所需的极限抗拉强度（UTS）为 42.0 ± 5.7 N（n = 10）。两组在第5天后抗拉强度均显著增加（p<0.0001）。比较两组发现，PRP组在各个时间点的UTS均更高，尤其是在第15天和第30天。通过测量在进行生物力学评估前取出的跟腱横截面积（未损伤跟腱为11.4 ± 5.5 mm2），发现第5天时生理盐水处理组的横截面积较大；但在第15天和第30天，PRP组的横截面积更大，尽管与生理盐水处理组相比，该数值的变异性更高（图4 和 图5）。
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讨论
血小板在肌腱愈合过程的早期炎症阶段起着至关重要的作用。当血小板暴露于诱导凝血的结缔组织或因子时，会释放储存在α颗粒中的生长因子。通过这一相互作用，细胞外基质大分子得以合成，间充质细胞发生增殖。血小板还对血液循环中的前体细胞具有趋化活性，可促进血管生成并刺激细胞分化6,20。
使用专为大鼠跟腱离体拉伸测试设计的夹具进行生物力学测试15。冷冻夹具可通过添加液氮使肌肉冻结，而作为标本下部的跟骨则直接固定在机器上。开始拉伸测试时，必须确保肌肉已完全僵硬，而肌腱仍保持柔韧性，这一点至关重要。该技术可避免组织损伤，保持力学完整性。此外，该方法操作简便、安全、无压迫性，且具有明确的可重复性，已有多个研究采用此方法4,15。
为了支持力学测试结果.......
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致谢
本研究由列日标准基金和莱昂·弗雷德里克基金的莱茹-莱希安资助项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 赛拉嗪（Xyl-M） | VMD | 无 | 麻醉剂 |
| 氯胺酮（Jétamine 1000 CEVA | CEVA Santé 动物 | 无 | 麻醉剂 |
| 布托啡诺（Vetergésic 多剂量 | ALSTOE | 无 | 止痛药 |
| iso-聚维酮碘 | MEDA-Pharma | 无 | 消毒剂 |
| 可吸收缝线Vicryl 6/0 | Johnson &安普和约翰逊 | ||
| Nembutal | CEVA Santé 动物 | 无 | 麻醉剂 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 保持组织结构的完整性 |
| 100% 异丙醇 | VWR | 20,922,364 | |
| 95% 乙醇 | VWR | 20,823,362 | |
| 二甲苯 | VWR | 28973.363 | |
| 石蜡 | VWR | LEIC3950.1006 | |
| 苏木精 | Millipore | 1.15938.0025 | 着色剂 |
| 伊红 | Millipore | 1.15935.0100 | 着色剂 |
| 伊红染液 | Sigma-Aldrich | 3989 | 封片剂 |
| CaCl2 |
参考文献
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al.
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