研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

摘要

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO₂ 大脑中动脉闭塞后 体内.

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，目前可用的治疗手段有限。作为一种内源性神经保护策略，缺血后处理已被证明是抗脑缺血的有前景疗法。然而，复杂的操作流程和潜在的安全问题限制了其临床应用。为克服这些缺点，我们开发了酸性后处理（APC）作为实验性局灶性脑缺血的治疗手段。APC是指在缺血后灌注期间通过吸入CO₂实现轻度酸中毒的治疗方法。本文介绍了分别用于实施APC的体外（in vitro）和体内（in vivo）两种模型。采用小鼠氧糖剥夺（OGD）处理以及小鼠皮质纹状体阻塞和大脑中动脉阻塞（MCAO）来模拟脑缺血。APC可通过将脑片转移至用20% CO₂气体饱和的酸性缓冲液，或让小鼠吸入20% CO₂气体来简便实现。APC在组织存活力和脑梗死体积方面的表现显示出对脑缺血显著的保护作用。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。近几十年来，人们为寻找有效的脑卒中治疗方法付出了巨大努力，但成果仍不理想。后处理是指在缺血事件发生后通过亚毒性刺激进行干预的一种过程。缺血后处理、缺氧后处理、低糖后处理以及远隔缺血后处理等均可激活内源性适应机制，已被证明是防治脑缺血具有前景的治疗策略^1,2,3,4。然而，缺血后处理可能带来额外的损伤。肢体远隔缺血后处理通常需要在同侧或双侧后肢进行数个循环的5–20分钟缺血与再灌注^5,6,7。因此，这些后处理操作在临床实践中存在风险或难以实施。为克服上述缺点，我们开发了APC作为小鼠局灶性脑缺血的治疗方法⁸。APC仅需通过吸入20% CO₂即可诱导，以更可行且安全的方式显著减轻缺血性脑损伤。近期我们进一步证实，APC可延长再灌注时间窗，凸显其在脑卒中治疗中的重要意义⁹。

本文介....

方案

所有实验均经浙江大学动物实验伦理委员会批准，并遵循其伦理准则进行，完全符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。实验过程中尽可能减少动物的任何疼痛或不适，并使用最少数量的动物。

1. 大脑皮层-纹状体脑片的氧糖剥夺

1. 溶液配制：
   1. 配制 1,000 mL r-ACSF（124 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L KH₂PO₄、2 mmol/L MgSO₄、26 mmol/L NaHCO₃、2 mmol/L CaCl₂、10 mmol/L 葡萄糖，最终 pH 为 7.4）。整个实验过程中用 5% CO₂ 和 95% O₂ 持续通气。
   2. 按上述方法配制 200 mL 无葡萄糖 ACSF（gf-ACSF），但不添加葡萄糖，并用 5% CO₂ 和 95% N₂ 通气。在应用于脑片前，先通气 30 分钟以降低溶液中的氧含量。持续通气直至氧糖剥夺（OGD）操作完成。
   3. 通过将 200 mL r-ACSF 与 20% CO₂ 和 80% O₂ 平衡来配制酸性 ACSF（a-ACSF）。....

结果

在上述描述的皮质-纹状体脑片模型中，于再灌注后1小时通过TTC染色法量化皮质-纹状体脑片的存活性。TTC转化率通过将490 nm处的吸光度归一化至对照脑片进行计算。根据TTC转化结果，酸中毒预处理对氧糖剥夺（OGD）诱导的再灌注损伤具有保护作用，且该保护作用具有起始时间和持续时间依赖性。具体而言，在15分钟OGD后5分钟进行酸中毒处理时，1分钟和3分钟的酸化处理均显著提高了脑片存活性，而5分钟处理则无此效果（OGD: 0.609 ± 0.029，5/1: 0.758 ± 0.034，5/3: 0.821 ± 0.041，5/5: 0.672 ± 0.053，数据以均值 ± 标准误表示）（图1A）。酸中毒处理的神经保护作用在再灌注后5分钟内仍存在，但在15分钟时则消失（OGD: 0.584 ± 0.044，0/3: 0.762 ± 0.036，5/3: 0.833 ± 0.062，15/3: 0.627 ± 0.038）（图1

讨论

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。在脑片模型中，再灌注开始后，将小鼠皮质纹状体脑片置于经20% CO₂气体饱和的酸性缓冲液中孵育以实现APC；而在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中，再灌注后通过让小鼠吸入20% CO₂实现APC。这两种模型均能反映APC对脑缺血的神经保护作用。其保护效果与缺血后处理相当，但具有更宽的时间窗。在MCAO模型中，APC的时间窗可长达再灌注后50分钟，而缺血后处理仅为10分钟¹⁵。此外，APC操作更为简便且安全性更高。

在皮质-纹状体脑片模型中，轻柔且快速的操作对于最大限度地保持脑片的活性至关重要。进行MCAO操作时，需要监测脑血流，并观察到血流急剧下降，以确认大脑中动脉的阻塞。在脑组织取出进行TTC染色后，必须仔细检查脑组织，以排除蛛网膜下腔出血。

酸中毒的强度和持续时间对于实现APC的神经保护作用至关重要。在皮质-纹状体脑片模型中，延长酸中毒处理时间并无益处（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma	S5886
氯化钾	Sigma	P5405
磷酸二氢钾	Sigma	P9791
硫酸镁	Sigma	M2643
碳酸氢钠	Sigma	S5761
二水合氯化钙	Sigma	C5080
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021
振动切片机	Leica	VT1000 S
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma	T8877
无水乙醇	阿拉丁工业公司	E111993
二甲基亚砜	Sigma	D8418
激光多普勒血流仪	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
无水乙醚	国药集团化学试剂有限公司	80059618
水合三氯乙醛	国药集团化学试剂有限公司	30037517
10% 福尔马林	阿拉丁工业公司	F111936
24 孔板	Jet Biofil	TCP-010-024