测量雌性叙利亚仓鼠在自然奖赏行为期间细胞外神经递质的体内变化

摘要

本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录，以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。

摘要

在快速时间尺度上测量神经递质释放的能力，使得神经传递模式能够与特定行为或实验干预相关联，这对于揭示潜在的机制和神经环路具有重要意义。尽管脑内微透析技术已使用数十年，可用于测量几乎任何感兴趣的分析物，但其时间分辨率有限。相比之下，快速扫描循环伏安法具有高时间精度和极高灵敏度；然而，由于该技术操作难度较高，且依赖于目标分析物的电化学活性，因此无法检测非电活性物质（例如，神经递质谷氨酸）。本文详细描述了一种即用型系统，该系统结合了固定电位安培法与酶法生物传感技术，可实现对电活性和非电活性神经递质的高时间精度测量。这两种强大技术的结合，使得张力性和时相性神经传递的测量变得更加简便，并支持多种神经递质的同时记录。本论文旨在展示在雌性仓鼠中，利用自然奖赏行为（即，性行为）在体测量多巴胺和谷氨酸神经传递的过程，最终目标是证明该检测方法在研究其他行为和实验范式中的技术可行性。

引言

在清醒活动的动物体内测量神经递质释放的能力，使研究人员能够将特定行为与神经递质传递在空间和时间上的动态模式联系起来——这是实时研究自然行为和操作性行为背后机制与神经环路的有力工具。传统上，微透析技术被用于测量脑内细胞外环境中具有电化学活性和非活性的物质¹。该技术通过微透析探针，以持续流动的方式灌注一种离子组成与细胞外液相似的水溶液，探针由一根细小的套管构成，其尖端为一段半透性的中空纤维膜²。探针植入脑内后，感兴趣的神经递质或其他分析物可通过被动扩散穿过半透膜，随后在设定时间点被收集，并利用高效液相色谱法（HPLC）进行后续分析。HPLC 是一种常用的分析化学技术，可用于分离、鉴定和定量复杂混合物中的各组分³。

尽管微透析是一种灵敏的技术，几乎可用于测量任何感兴趣的分析物，但其时间分辨率较低，最高采样速率仅为数分钟至数十分钟量级^1,2。快速扫描循环伏安法（FSCV）的发明弥补了这一不足，该技术依赖于电活性物质的氧化还原电位，能够揭示细胞外液中目标分析物近乎瞬时的浓度变化。简而言之（详见Robinson et al.⁴ 的综述），通过电极在短时间内以三角波形....

方案

本研究所述所有操作程序均经明尼苏达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并符合《实验动物照护与使用指南》¹³ 的规定。

1. 动物与插管手术

1. 从常见的实验动物供应商处获取约55日龄的叙利亚仓鼠。
   注意：尽管由于不同实验范式的限制，实验动物的年龄可能有所差异，但在研究性行为时，应获取年龄相近且均已达到性成熟的动物。
2. 在温度可控（22 °C）和光照可控（14小时光照后接10小时黑暗，光照于13:00关闭）的环境中饲养动物，自由供应食物和水 随意摄取 除非在实验测试期间。
   注意：由于仓鼠具有季节性繁殖特性，该14小时光照/10小时黑暗的光周期模拟了其自然繁殖条件。
3. 在实验室适应1周后，在全身麻醉下进行无菌双侧卵巢切除术和颅内立体定位套管植入术例如，戊巴比妥），并按照先前所述方法给予适当的机构批准的术后镇痛和抗生素治疗^14,15.
   注意：在性行为研究中，必须进行卵巢切除术以去除内源性性激素的主要来源，从而使动物能够根据实验时间线，通过外源性激素处理被统一诱导进入性接受状态。
   1. 对于多巴胺能和谷氨酸能探针的植入，通过立体定位仪植入导管套管（直径0.7 ....

结果

利用上述电化学与行为编码方法，本实验室已开始表征在性行为的in vivo记录过程中，多巴胺和谷氨酸的紧张性与时相性波动。由于该方法具有时间上的精确性，我们能够更准确地刻画性行为期间的神经递质传递，并将释放模式的特定变化归因于交配过程中的紧张性变化，以及雌性在接受雄性爬跨所实施的单个交配行为（e.g.，插入、射精）时出现的相应瞬时波动。

具体而言，我们采用该方法重点测量不同动物伏隔核（NAc）中多巴胺和谷氨酸的释放模式。NAc 是参与奖赏处理的关键脑区²²，也被认为是调控性行为奖赏特征的核心区域之一²³。

我们观察到，在性行为过程中，雌性在交配阶段会出现伏隔核（NAc）核心区多巴胺能水平的紧张性升高（

讨论

尽管该技术相对简单直接，但在使用过程中仍可能出现一些问题。首先，探针的立体定位放置必须精确：与微透析技术能够采集探针周围较广范围的细胞外环境样本不同，该技术仅能检测直接接触到探针的神经递质。其次，在使用碳纤维记录探针时，由于纤维直径较小，容易发生断裂，因此探针插入时必须格外小心。对于谷氨酸生物传感器而言，若未在保证有效的3周时间内使用，可能发生酶活性降解。幸运的是，上述所有问题均可通过适当的谨慎操作和细致注意加以解决并完全避免。

在固定电位碳纤维记录的特异性方面可能存在一个潜在的问题。由于多巴胺的施加电位与其他单胺类物质（如去甲肾上腺素）的电位重叠，如果在同时释放这两种神经递质的脑区进行记录，则这种化学特异性不足的情况可能会限制对结果的解释。但在伏隔核（NAc）中，这一问题并不严重，因为多巴胺是该区域主要的儿茶酚胺类神经递质²⁴。由于NAc中约98%的细胞为中等棘状神经元，这些细胞对多巴胺能神经传递有反应²⁴，因此信号更倾向于检测多巴胺，从而有利于采用这种更即用型的技术方法。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	注射用戊巴比妥钠，USP。本实验室使用剂量为每100克体重8.5 mg，腹腔注射。
洛昔康镇痛剂	Norbrook Laboratories	6451603670	非甾体抗炎镇痛药，用于术后疼痛控制。通用名：美洛昔康。
恩诺氟沙星抗生素	Norbrook Laboratories	5552915411	氟喹诺酮类抗生素，用于预防术后感染。通用名：恩诺氟沙星。
Beuthanasia-D	默克动物保健	00061047305	戊巴比妥钠、苯妥英钠安乐死试剂。
骨螺钉	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" 骨螺钉（每包16个），用于将颅骨帽固定于颅骨。
牙科丙烯酸树脂（Bosworth Duz-All）	Bosworth	166261C	自凝牙科丙烯酸树脂，用于构建颅骨帽，以固定套管和头部固定装置至颅骨。
硬件生物传感器系统套装	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle为首次使用本公司的有线生物传感器系统的大鼠实验用户提供完整的硬件套件。套件包括换向器、前置放大器以及数据调理与采集系统。
基础视频计算机套装	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	基础计算机套装包含一台预配置计算机，具备充足的硬盘存储空间、高清显示器、键盘和鼠标、不间断电源以及所有必要连接线缆。
Video EQ700 EverFocus 摄像头 套装	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 具备夜视功能的盒式摄像头，配有独立红外光源，作为Pinnacle视频计算机套装的一部分提供。圆顶摄像头（9000-K9）和高清摄像头（9000-K11）也可选配。
Sirenia 采集软件	Pinnacle Technologies, Inc.	免费——可从pinnaclet.com下载	Sirenia 采集软件提供统一平台，用于记录来自任何Pinnacle硬件系统的数据。该软件支持所有数据流的同步、用户可配置设置、数据整合以及多种导出选项。此外，软件还包含用于生物传感器记录的基本回放与分析模块。Sirenia 提供免费的一体化软件，非常适合数据采集与回放。
大鼠有线 体外 校准套件	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	为将生物传感器测得的电流变化与分析物实际浓度变化相关联，必须在将传感器植入动物体内之前对其进行校准。该过程还可验证传感器的完整性与选择性。 校准套件包括20 mL夹套烧杯（#7058）、1/2" × 1/8" 磁力搅拌子（#7059）、直角夹（#7056）、双爪单调节夹（#7055）、4通道校准前置放大器（#7053）以及校准支架（#7051）。
搅拌器	Corning	6795-410D	Corning 数字搅拌器，5" × 7"，120 VAC，用于在体外校准谷氨酸生物传感器时驱动夹套烧杯内的磁力搅拌子。
具备闭环循环功能的水浴锅	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L 标准数字加热循环水浴锅，120VAC，通过塑料管路将夹套烧杯加热至生理温度。
带BASi大鼠套管的碳纤维传感器	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	用于记录多巴胺神经传递的碳纤维电极。
Ag/AgCl参比电极	Pinnacle Technology, Inc.	7065	碳纤维记录所必需。
谷氨酸生物传感器	Pinnacle Technology, Inc.	7001	用于记录谷氨酸能神经传递的酶法生物传感器探针。
BASi导向套管	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	植入目标脑区的导向套管，用于引导探针。
BASi大鼠用塑料头帽	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	头部固定装置用于稳定探针并连接至恒电位仪。