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方法文章

使用实时 PCR 检测血清和血浆中的拷贝数

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DOI：

10.3791/56502

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2017年12月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

本文内容

摘要

本文描述了采用实时PCR方法对血清或血浆DNA进行拷贝数变异分析的过程。该方法适用于预测去势抵抗性前列腺癌患者的药物耐药性，但也可为其他疾病提供有价值的信息。

摘要

血清和血浆中的游离DNA（cfDNA）已被证明是癌症诊断、预后评估、疗效监测以及预测治疗耐药性的信息丰富且无创的生物标志物来源。基于雄激素受体（AR）基因拷贝数（CN）增加是转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）中常见事件的假设，我们提出在cfDNA中分析该事件，作为潜在的预测性生物标志物。

我们采用两种不同的实时PCR检测方法和两个参考基因（RNaseP 和 AGO1）对cfDNA中的AR拷贝数（CN）进行了评估。每次检测组合使用60 ng的DNA量。为获得更准确的结果，我们采用数字PCR验证了AR拷贝数的增加。拷贝数变异分析已被证实可用于预测转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）治疗耐药性，但也可能适用于其他患者群体中的不同用途。基于cfDNA的拷贝数分析具有多项优势：具有非侵入性、操作快速简便，且仅需少量血清或血浆样本即可开展。

引言

血液中循环的游离DNA（cfDNA）已被证明是癌症诊断、预后评估、疗效监测以及治疗耐药性预测的理想生物标志物来源1,2。许多研究已证实，组织中的DNA改变（如突变、拷贝数变异、表观遗传修饰）与相应血浆样本中检测到的改变具有良好的一致性1，表明循环肿瘤DNA（ctDNA）能够有效反映原发性和转移性肿瘤组织的基因组改变3。对ctDNA的研究使得重建特定癌基因的基因组重排和拷贝数变异（CNVs）成为可能4，从而识别潜在的转移性克隆和亚克隆细胞。ctDNA在临床中尤其适用于癌症治疗的动态监测，因其携带与特定靶向治疗相关的特异性突变和拷贝数变异5,6。此外，ctDNA检测避免了组织活检的需要，能够在特定癌症治疗过程中以非侵入性方式在不同时间点获取检测结果。

关于前列腺癌，循环游离雄激素受体（AR）拷贝数变异（CNV）与阿比特龙和恩杂鲁胺治疗反应之间存在显著相关性，表明血浆游离DNA（cfDNA）中的AR基因拷贝数（CN）可能是预测治疗耐药性的有前景的生物标志物7,8,9,10,11。ctDNA中特定基因的拷贝数变异可通过多种方法进行检测，这些方法在灵敏度、成本和检测速度方面各不相同（例如 实时定量PCR、数字PCR和下一代测序）。

本文介绍一种基于实时荧光定量PCR技术中双重检测方法的简单快速策略，用于评估血清和血浆样本cfDNA中AR的拷贝数（CN）7,8。我们设计了两个不同的PCR检测，分别靶向位于AR基因（Xq12）第5内含子内的两个不同基因组区域，并选用另外两个基因作为内部标准参考基因，这两个基因在前列腺癌中通常具有正常的拷贝数状态（RNaseP，位于14q11；AGO1，位于1p34）。我们选择使用两个参考基因而非一个，以提高结果的精确性和灵敏度。每种检测组合均使用60 ng DNA进行扩增（AR-assay_1+RNaseP 和 AR-assay_2+AGO1 的联合检测）。将来自三名健康男性的血清或血浆DNA样本混合后作为校准品。我们将AR拷贝数增益的判断阈值设为>1.5，缺失的判断阈值设为<0.5。该方法的主要优势之一在于其灵活性，可根据肿瘤类型和特征，通过更换内部参考基因，对其他基因进行同步评估。

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方案

该方案包括从血清或血浆样本中分离DNA，以进行实时PCR拷贝数分析。实验步骤包括DNA提取、DNA定量控制（分光光度法）以及针对特定目标的实时PCR。在图1中，列出了实验流程和时间安排的概要。

该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指南。

1. 血清采集与处理

  1. 采集约 5 mL 全血至不含抗凝剂的血清管中以获取血清。处理前将血样管保持在 4 °C。
  2. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 15 分钟。
  3. 小心将血清转移至 2 mL 管中。
  4. 弃去采血管，并立即将上清液在 -80 °C 冻存，直至使用。

2. 血浆采集与处理

  1. 采集约 10 mL 全血至含 EDTA 的血浆管中以获取血浆。将试管完全填满后，轻轻倒置 8 次。在处理前将血液样本管保持在 4 °C 环境中。
  2. 在室温下以 1,800 × g 离心 15 分钟，离心时离心机不启用刹车功能。
  3. 小心地将上层血浆转移至 2 mL 离心管中。重复转移操作，每次需在白细胞层上方至少保留 1 mL 上清液。
    注意：仅转移上清液的上层部分可降低细胞或细胞碎片污染的风险。
  4. 弃去原始采集管，并立即将上清液在 -80 °C 冻存，直至后续使用。

3. 从血清或血浆中分离DNA

注意：应使用以下步骤修改的商业试剂盒说明书，从血清或血浆中分离DNA。

  1. 在室温下解冻一份血清或血浆样品（体积为 0.5 至 2 mL）。
  2. 涡旋混匀样品，将 0.5 mL 血清或血浆转移至一个透明的 1.5 mL 离心管中。其余样品于 -80 °C 冻存。
  3. 直接向样品中加入 50 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）。
  4. 向样品中加入 0.5 mL 裂解缓冲液，用移液器充分混匀。
  5. 盖紧管盖，将样品置于金属浴中 56 °C 孵育 15 分钟。
  6. 根据生产商说明书指示，在洗涤缓冲液 1 和 2 中加入相应体积的 100% 乙醇。
  7. 将样品恢复至室温，加入 0.5 mL 无水乙醇，用移液器充分混匀。
  8. 取步骤 3.7 所得混合液 650 µL 加入分离柱中，于 6,000 × g 离心 1 分钟。
  9. 弃去含有穿流液的收集管，将柱子放入新的洁净收集管中。重复步骤 3.8 和 3.9 一次。
  10. 加入 500 µL 洗涤缓冲液 1，注意不要润湿柱子边缘，于 6,000 × g 离心 1 分钟。
  11. 弃去含有穿流液的收集管，更换为新的洁净收集管。
  12. 加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，注意不要润湿柱子边缘，于最大转速（20,000 × g）离心 3 分钟。
  13. 弃去含有穿流液的收集管，更换为新的洁净收集管。
  14. 于最大转速（20,000 × g）离心 3 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。
  15. 将柱子放入一个洁净的 1.5 mL 离心管中，加入 150 µL 洗脱缓冲液，静置 7 分钟，确保缓冲液充分润湿柱子。
  16. 于 8,000 × g 离心 1 分钟。
  17. 将步骤 3.16 中所得洗脱液重新移入同一柱子中，于最大转速（20,000 × g）离心 1 分钟，以确保 DNA 的最大回收率。

4. DNA 定量与稀释

  1. 使用分光光度计对 DNA 进行定量。根据制造商说明书，取 2 µL 样品在台式分光光度计上进行测定。
    注意：如果 DNA 量不足以进行实时 PCR（至少 120 ng），则需重新进行 DNA 提取。
  2. 将血清或血浆中的 DNA 稀释至 2.5 ng/µL，最终体积应足以满足所有实时 PCR 反应所需（约 50 µL）。

5. 实时荧光定量PCR

  1. 将拷贝数检测试剂、内参基因检测试剂、稀释后的DNA样品以及混合校准品置于冰上解冻。将储存于4 °C的预混液在室温下平衡。
  2. 为每个样品和混合校准品的3个重复反应配制混合液，每份混合液包含1 µL目标检测试剂、1 µL内参基因检测试剂和10 µL预混液。同时配制包含阴性对照（水）及额外2个样品的混合液。
  3. 在96孔板中，向每孔分装12 µL上述混合液。不要对管子进行吹打或离心。
  4. 向每孔加入8 µL（浓度为2.5 ng/µL）的各DNA样品及混合校准品。不要对管子进行吹打或离心。每孔更换新的吸头。
    注意：每次实时荧光定量实验使用96孔板可处理30个DNA样品：30个样品 × 3重复 + 1个混合校准品 × 3重复 + 阴性对照 = 共94孔。
  5. 将96孔板在1,000 × g条件下短暂离心。
  6. 按照以下程序运行反应：95 °C孵育10分钟；进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和60 °C退火延伸1分钟。

6. 数据分析与解释

  1. 在该部分 "选项"在扩增曲线结果下方，将首个分析的目标基因的Ct阈值设定为0.2。对每个目标基因或参考基因重复此设定。要以.txt格式导出实时PCR文件，请按下 "导出" 进入工具栏。仅标记 "结果" 在“选择要导出的数据”中 → 选择文件类型为 .txt 扩展名 → 按下 "开始导出" → 关闭导出工具。
  2. 打开分析软件并导入 .txt 文件（工具栏 → 导入）。
  3. 选择要分析的文件名，并通过工具栏（播放符号）选择分析设置。
  4. 指定校准品样本及目标拷贝数例如， 1 份用于 雄激素受体 基因）。按压 "应用。"
  5. 每个样本中，剔除一个与其他孔相比具有不同ΔCt值的孔。
  6. 重新分析实验（按下播放按钮）。
  7. 通过拷贝数条形图或表格评估结果。
    注意：结果表格包含多个参数，如置信度、Z分数和已分析的重复次数，这些参数对结果解读可能具有参考价值。

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结果

所有样本的总cfDNA浓度均可通过分光光度法测定，其中血清样本的中位浓度为6.12 ng/µL（范围：2.00 - 23.71 ng/µL），血浆样本的中位浓度为3.21 ng/µL（范围：2.31 - 8.49 ng/µL）。我们共对115个样本进行了实时PCR实验分析。

使用高扩增或低扩增患者混合血清DNA评估检测灵敏度 雄激素受体以及来自健康供体的DNA，后者也用作拷贝数分析的校准样本。如图所示 图2, 雄激素受体 在含有患者0.375% DNA的样本中可充分检测到CN 雄激素受体 与健康供体DNA混合以获得可检测的基因增益（图2因此，该方法检测到了极低水平的拷贝数增加。计算了每位患者在拷贝数检测中ΔCt的标准差（中位数 ± 标准差 = 0.1，范围：0.00 - 0.36）...

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讨论

AR 拷贝数分析在血清和血浆样本中代表了一种新的无创方法，可用于对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者进行分层。最近的研究表明，在接受阿比特龙和恩杂鲁胺治疗的CRPC患者中，无论是在化疗前还是化疗后，AR 拷贝数均能够预测治疗结局7,8,9,10。

本方法的主要优势在于其实验流程极为简便，仅包括DNA提取、一次实时PCR分析以及简单的数据分析。此外，该检测可在1个工作日内快速完成，且成本低廉（每个样本约20美元）。我们已证实，该方法具有高度可重复性，所得结果与更昂贵且精确的方法（包括数字PCR7,8）的结果一致。此外，我们在经阿比特龙治疗的血浆样本中，使用靶向NGS方法检测到的<...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢 Chiara Molinari 和 Filippo Martignano 在数据分析方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Vacutainer 血清管Becton Dickinson367814用于血清的全血采血管
BD Vacutainer EDTA 管Becton Dickinson366643用于血浆的全血采血管
无水乙醇VWR用户也可使用其他公司的产品
TaqMan 拷贝数检测Thermo Fisher Scientific4400291预设计并已验证的含 FAM 荧光染料的检测。我们使用了以下检测：AR_assay1: hs04107225 和 AR_assay2: hs04511283
TaqMan 拷贝数检测（修饰版）Thermo Fisher Scientific4467084经修饰加入 VIC 荧光染料的预设计检测：AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan 拷贝数参考检测（人源，RNase P）Thermo Fisher Scientific4403326
TaqMan 通用 PCR 主混合液Thermo Fisher Scientific4326708实时 PCR 用主混合液
QIAamp DNA Mini Kit (50)Qiagen51304DNA 提取试剂盒
MicroAmp 96 孔板Thermo Fisher ScientificN8010560用于实时 PCR 的板
NanoDrop 1000 分光光度计Thermo Fisher Scientific-用户也可使用其他分光光度法来定量 DNA
7500 Fast 实时 PCR 系统Applied Biosystem-用户也可使用其他实时 PCR 仪器
CopyCaller 软件Applied Biosystem-用于拷贝数分析的软件

参考文献

  1. Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
  2. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
  3. Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
  4. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
  5. Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
  6. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  7. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  8. Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
  9. Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
  10. Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
  11. Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
  12. Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
  13. Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).

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