应用实时 PCR 技术检测血清和血浆拷贝数

Summary

这篇手稿描述的拷贝数变异分析进行血清或血浆 DNA 使用 real-time PCR 方法。该方法适用于抗去势前列腺癌患者的耐药性预测, 但也可为其他疾病提供信息。

Abstract

血清和血浆细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是一个信息, 无创的生物标志物的癌症诊断, 预后, 监测和预测的治疗阻力。从雄激素受体 (AR) 基因拷贝数 (CN) 增益是转移性去势抵抗前列腺癌 (mCRPC) 的一个常见事件的假说出发, 我们建议在 cfDNA 中分析这一事件作为一个潜在的预测生物标志物。

我们使用2不同的 real-time PCR 方法和2参考基因 (RNaseP和前1) 在 cfDNA 中评估了AR CN。每种化验组合均使用 60 ng 的 DNA 量。AR利用数字 PCR 技术确定 CN 增益是一种较为准确的方法。CN 变异分析已经被证明在 mCRPC 的设置中对治疗阻力的预测是有帮助的, 但在不同的病人设置中也可以用于其他用途。CN 对 cfDNA 的分析有几个优点: 无创、快速、易于执行, 并从少量的血清或血浆材料开始。

Introduction

血液中的循环细胞游离 DNA (cfDNA) 已被证明是肿瘤诊断、预后、监测和治疗耐药性预测的最理想的生物标志物来源^1,2。许多研究表明, 在组织中的 DNA 改变 (突变, 拷贝数变异, 表观修饰) 和对应的血浆样本中发现的¹, 证实了循环肿瘤 dna (ctDNA) 的良好一致性初级和转移性肿瘤组织改变的信息³。研究 ctDNA 的可能性因而允许重建基因组重和拷贝数字变异 (cnv) 在具体致癌基因⁴, 辨认可能的转移的克隆和 subclonal 细胞。CtDNA 已被证明是临床有用的, 特别是癌症治疗监测, 因为它的特定的基因突变和 cnv, 相关的特定靶向治疗^5,6。它还克服了组织活检的需要, 并允许在不同的时间在特定的癌症治疗非侵入性的方式获得的结果。

关于前列腺癌, 循环无细胞雄激素受体 (ar) cnv 和治疗反应的阿比特龙和 enzalutamide 的显着相关性已经显示, 表明AR基因复制号 (CN) 在 cfDNA 可能是一个有前途的生物标志物能够....

Protocol

该协议包括从血清或血浆样品中分离出 DNA, 以进行 real-time PCR 进行拷贝数分析。对特定靶点进行 dna 提取、dna 量控制 (分光光度计) 和 real-time PCR。在图 1中, 报告了过程和时间线的摘要。

该议定书遵循红外人类研究伦理委员会的准则。

1. 血清采集与处理

1. 在没有抗凝血的血清管中收集大约5毫升全血, 以获得血清。在4° c 时保持血液管直到加工。
2. 离心管在 1000 x g 为 15 min 在4° c。
3. 小心地将血清转化为2毫升的管子。
4. 丢弃收集管, 并立即冻结上清在-80 ° c, 直到使用。

2. 等离子采集与处理

1. 在等离子体管中收集大约10毫升全血, 用 EDTA 获得血浆。完全填充管, 然后倒置8次。在4° c 时保持血液管直到加工。
2. 离心管在 1800 x g 为15分钟在室温下没有刹车设置在离心机。
3. 小心地将血浆的上部转换成2毫升的管子。重复转移, 在白细胞层上方至少留下1毫升的上清液。
   注: 上部上清的转移降低了细胞或细胞碎片的污染风险。
4. 丢弃收集管, 并立即冻结上....

Results

对所有样品进行分光光度法测定的总 cfDNA 浓度, 显示 6.12 ng/µL (范围: 2.00-23.71 ng/µL) 的血清样品的中位数和 3.21 ng/µL (范围: 2.31-8.49 ng/µL) 血浆样品的中位数。通过 real-time PCR 实验, 我们总共分析了115样品。

对AR的高或低增益患者的混合血清 dna 和健康捐献者的 dna 进行了测试灵敏度评估, 这也被用作拷贝数分析的校验仪样本。如图 2所示, ar CN 在0.375% 的患者 dna 中得到充分检测, 其中ar增益与健康的供体 dna 混合, 以获得可检测到的基因增益 (图 2)。因此, 这种方法检测到的拷贝数增益非常低。计算了每位患者的ΔCt 标准偏差 (中等± SD = 0.1,.......

Discussion

AR血清和血浆样品中的 CN 分析是一种新的非侵入性方法, 用于去势抗前列腺癌 (不动产) 患者的分层。最近已经证明, AR CN 能够预测不动产患者治疗阿比特龙和 enzalutamide, 化疗前后的结果^7,8,9,10。

我们的方法的主要优点是, 该协议是非常简单的执行, 包括只有一个 DNA 隔离过程, 一个 real-time PCR 分析和简单的数据解释。此外, 该测试可以在1工作日内快速完成, 而且程序也很便宜 (大约每样20美元)。我们已经证明, 这种方法是高度重现性的, 并取得的结果是符合那些来自更昂贵和准确的方法, 包括数字 PCR^7,8。此外, 我们发现了.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer 血清管	Becton Dickinson	367814	血清全血管
BD Vacutainer EDTA 管	Becton Dickinson	366643	全血管
乙醇 绝对	VWR		用户也可以使用其他公司
TaqMan 拷贝数测定	Thermo Fisher Scientific	4400291	使用 FAM 染料进行预设计和验证的分析。我们使用以下检测方法： AR_assay1：hs04107225 和 AR_assay2：hs04511283
TaqMan 拷贝数检测（修饰）	Thermo Fisher Scientific	4467084	经 VIC 染料修饰的预设计检测：AGO1：Hs02320401_cn
TaqMan 拷贝数参考检测，人，RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan 通用 PCR 预混液	Thermo Fisher Scientific	4326708	用于实时荧光定量 PCR 的预混液
QIAamp DNA 小量套装 （50）	Qiagen	51304	DNA 提取试剂盒
MicroAmp 96 孔板	实时荧光定量 PCR	的 Thermo Fisher Scientific	N8010560
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	-	用户还可以使用其他分光光度法方法定量 DNA
7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystem	-	用户还可以使用其他实时仪器
CopyCaller 软件	Applied Biosystem	-	软件进行拷贝数分析