Summary
Vi præsenterer her, en protokol for non-invasiv vurdering af oocyt udviklingsmæssige kompetence udført under deres i vitro modning fra den germinale vesikel metafase II scenen. Denne metode kombinerer time-lapse imaging med partikel billede Velocimetri (PIV) og neurale netværk analyse.
Abstract
Infertilitet klinikker ville drage fordel af muligheden for at vælge udviklingshæmmede kompetente vs inkompetente oocyter ved hjælp af ikke-invasive procedurer, dermed forbedre det samlede graviditet resultatet. Vi har for nylig udviklet en klassificeringsmetode baseret på mikroskopiske levende observationer af musen oocyter under deres i vitro modning fra den germinale vesikel (GV) metafase II scenen, efterfulgt af en analyse af cytoplasmatisk bevægelser forekommende i denne time-lapse periode. Vi præsenterer her, detaljerede protokoller af denne procedure. Oocytter er isoleret fra fuldt udvokset antral follikler og kulturperler for 15 h inde i et mikroskop udstyret for time-lapse analyse ved 37 ° C og 5% CO2. Billederne er taget med 8 min. mellemrum. Billederne er analyseret ved hjælp af metoden partikel billede Velocimetri (PIV), der beregnes for hver oocyt profil af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) forekommer i hele perioden kultur. Endelig, CMVs af hver enkelt oocyt fodres gennem en matematisk klassificering værktøj (Feed-forward kunstige neurale netværk, FANN), der forudsiger sandsynligheden for en gamet udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente med en nøjagtighed på 91.03%. Denne protokol, sat op til musen, kan nu blive testet på oocytter af andre arter, herunder mennesker.
Introduction
Kvindelig infertilitet er en patologi, som berører et stigende antal kvinder. Ifølge World Health Organization er omkring 20% af parrene ufrugtbar, med en 40% på grund af kvindelig infertilitet. Desuden er en tredjedel af kvinder, der gennemgår kræftbehandling (300.000 pr. år og 30.000 pr. år i USA eller Italien, henholdsvis) udvikle tidligt ovariesvigt.
En strategi til forebyggelse af barnløshed hos kræftpatienter er isoleret og kryopræservering af ovariefollikler før onkologisk behandling, efterfulgt af in vitro- modning (IVM) af GV oocyter MII fase (GV at MII overgang). Tilgængeligheden af non-invasiv markører for oocyt udviklingsmæssige kompetence ville forbedre befrugtningen og udviklingsprocesser og den samlede graviditet succes1,2.
Baseret på deres kromatin konfiguration observeret efter farvning med den supravital fluorokrom Hoechst 33342, pattedyr fuldt udvokset oocyter klassificeres enten som en omgivet Nucleolus (SN) eller en ikke omgivet Nucleolus (NSN)3. Udover deres forskellige kromatin organisation vise disse to typer af oocytter mange morfologiske og funktionelle forskelle3,4,5,6,7,8 ,9, herunder deres meiotiske og udviklingsmæssige kompetence. Når isoleret fra æggestokken og modnet i vitro, begge type oocyter reach MII fase, og efter sæd insemination, udvikle til de 2-celle stadium, men kun dem med en SN kromatin organisation kan udvikle sig til begrebet9. Selvom god som en klassificeringsmetode for at vælge kompetente vs inkompetente oocytter, er den største ulempe de mutagene virkning, som fluorokrom, sig selv og først og fremmest UV-lys bruges til dens afsløring kan have på cellerne.
Af alle disse grunde søgte vi efter andre non-invasiv datamærker forbundet med SN eller NSN kromatin kropsbygning som kunne erstatte brugen af Hoechst samtidig opretholde samme høje klassificering nøjagtighed. Time-lapse observation af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) fremstår som en funktion karakteristiske celle status. Nylige undersøgelser påviste f.eks, association mellem CMVs registreres på tidspunktet for befrugtning og kapacitet af mus og menneskelig zygotes til komplet præimplantationsdiagnostik og fuldbårne udvikling10,11.
Baseret på disse tidligere undersøgelser, beskriver vi her en platform for anerkendelse af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter5,6,7,8. Platformen er baseret på tre vigtigste skridt: 1) oocyter isoleret fra antral follikler er først klassificeret baseret på deres kromatin konfiguration enten som en omgivet nucleolus (SN) eller en ikke-omgivet nucleolus (NSN); 2) time-Lapse billeder af CMVs opstår under GV at MII overgangen af hver enkelt oocyt er taget og analyseret med partikel billede Velocimetri (PIV); og 3) oplysninger indhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige neurale netværk (FANN) for blinde klassificering12,13. Vi give nærmere oplysninger om de mest kritiske trin i den procedure, der er designet til musen til at gøre det klar tilgængelige til at blive testet og bruges til andre pattedyr arter (fx kvæg, abe og mennesker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug og etiske udvalg på universitetet i Pavia. Dyrene blev opretholdt under 22 ° C, 60% luftfugtighed og en lys/mørke cyklus på 12:12 h.
1. æggestokken Isolation
- Injicere intraperitoneal 2 fire til elleve uger gamle CD1 hunmus med 10 U af follikelstimulerende hormon med en steril 1 mL insulin sprøjte.
- Vente 46-48 h.
- Vejer musen og bedøver med en intramuskulær injektion på 50 mg/kg af Zoletil (Tiletamina og Zolazepan cloridrate). Aflive af cervikal dislokation.
- Tag fat i huden, der dækker den abdominale væg ved hjælp af et par af dissektion pincet. Skær huden og kroppen væggen med et par sakse og pull åbne snittet med pincet.
- Med en pincet, flytte modet til side, lokalisere de uterine horn og lokalisere æggestokkene på deres ekstremiteter.
- Forsigtigt holde æggestokken ved hjælp af urmager pincet og bruge saks til at klippe sin ligament i livmoderen. Gentag med anden æggestokken.
- Overføre indsamlede æggestokkene til en 35-mm celle kultur petriskål indeholdende 1 mL af M2 isoleret medium pre varmes ved 37 ° C, 5% CO2 i luften.
- Fjern fedt og oviduct ved hjælp af fine saks under et stereomikroskop.
2. isolering af Cumulus oocyt komplekser
- Punktere æggestokkene overfladen med sterile pincetter og en 1G sterilt insulin nål indtil antral cumulus oocyt komplekser (p-piller) frigives passivt.
- Indsamle p-piller med mere end tre lag af cumulus celler ved hjælp af en mund-kontrollerede hånd-trukket Pasteur mikropipette (200 µm i diameter) og overføre dem til en 300 µL dråbe frisk M2 medium.
- Fjern cumulus celler omkring oocyter ved hjælp af en hånd-trukket Pasteur mikropipette (80 µm i diameter) ved forsigtigt pipettering ind og ud for få sekunder,
- Gentagne gange overføre oocytter fra en 20 µL dråbe M2 medium til et andet, indtil cumulus celler er helt elimineret.
3. kromatin organisation-baserede oocyt klassificering
- Forberede Hoechst 33342 Farvningsopløsningen i en endelig koncentration på 0,05 µg/mL i M2 medium start fra en mor løsning på 5 mg/mL fortyndet i 1 x PBS.
- Sted 3.5 µL mikro dråber af Hoechst farvning løsning i bunden af en 35 mm petriskål låg.
- Overføre hver enkelt oocyt til en Hoechst farvning drop, Placer skålen på en pre varmede (37 ° C) varme tallerken og dække det med en mørk låg til at undgå lys exposition.
- Efter 10 min inkubation ved stuetemperatur, observere oocyter med et fluorescens mikroskop ved 10 X forstørrelse under UV-lys (330-385 nm), for ikke mere end 1-2 s.
- Klassificere oocyter som en omgivet nucleolus (SN) (figur 1A), hvis de udgør en ring af Hoechst-positive kromatin omkring nucleolus.
- Klassificere oocyter som en ikke omgivet nucleolus (NSN), hvis deres nucleolus ikke er omgivet af Hoechst-positive kromatin og viser sprede heterochromatic steder inden for kernen (figur 1B).
4. neurale netværks-baserede oocyt klassificering
- Forberede fire 2 µL dråber af α-MEM medium suppleret med 5% varme-inaktiverede føtal bovint serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM taurin, 100 U/mL penicillin, 75 µg/mL streptomycin og 23,5 µg/µL natrium pyruvat i en 35-mm glas bund petriskål og dække dem med pre varmede (37 ° C) og pre afbalancerede mineral olie til at undgå medium fordampning.
Bemærk: Hvis du bruger en levende celle-screening system, holde dråberne i en bestemt afstand ved hjælp af en trukket gitter af 7 mm x 7 mm som en retningslinje. - Overførsel 3 - 4 oocytter til hver dråbe.
- Placer glas bund petriskål i en levende celle-screening system, udstyret med time-lapse optagelse software (Se Tabel af materialer), som giver mulighed for observation af oocyt modning i et miljø med stabile temperatur (37 ° C) og CO2 koncentration (5%).
- Åbn time-lapse optagelse software. På skærmen vises et vindue med en levende skud af oocyt på venstre side og alle indstilling knapper på højre side.
- Marker midten af oocyt at placere det på skærmen center. Fokusér, hvis nødvendigt.
- Vælg knappen Ph og indstille DIA lampe til 192; eksponeringstiden til 1/125 s; få til 1,99; og opløsning på 1600 x 1200.
- Vælg FL2 og sæt DIA lampe til 5; eksponeringstiden til 3 s; få til 2,37; og opløsning på 1600 x 1200.
- Vælg knappen New punkt for at optage oocyt position inden for drop-kultur. Gentag den samme rutine for hver oocyt inden for kultur-drop.
- Vælg tid og angive den erhvervelse cyklus til 8 min og den samlede tid til 15 h.
- Vælg Start time-lapse at starte optagelse cyklus.
- Åbne MATLAB software og skrive >>cell_piv; og vælg derefter PIV værktøj.
- Vælg mappen med den optagne film og nogen af .jpeg-filer til at indlæse hele billede sekvensen. Vælg regionen af interesse (ROI) ved at klikke på Vælg område værktøjfor hver oocyt.
- Vælg Proces PIV i menuen filer. Vælg knappen Viewer værktøj .
Bemærk: Programmet vil beregne hastighed vektorer inden for ROI og producerer automatisk en datafil, gemmes som en .mat fil. - Vælg filen .mat åbne. Vælg knappen Vælg ROI tool og tegne en cirkel omkring omridset af oocyt. Klik på Gem i menuen fil.
Bemærk: Vektorer i dette område vises nu og den gennemsnitlige størrelsesorden data i vinduet graf opdateret for denne nye ROI. - Åben indsamlede gennemsnitlige størrelsesorden data for hele time-lapse frames registreres i et regneark, med på rækker, ramme sequence og på søjler, hver enkelt oocyt analyseret.
- Organisere data af både NSN og SN oocyter i 10 undergrupper.
- Bruger 9 undergrupper til at træne den feed-forward kunstige neurale netværk iterativt (FANN) og 1 undergruppe for blind test.
- Gentage en anden 9 gange, ændre blind test stikprøven (10-fold cross-validering).
- Åbne MATLAB, køre skræddersyede script vigtigste og, på anmodning, indsætte navnet på filen med træningsdata (train.txt), antallet af NSN og SN oocyter anvendes til uddannelse og time-lapse intervallet skal analyseres (typisk, fra billede # 1-2 til stel # 112-113).
- Tryk på Angiv at udføre træningen.
- Indsætte navnet på filen med testdata (test.txt).
- Åbn vektor test_outputs_cyt i MATLAB arbejdsområde.
Bemærk: Der vises et vindue på skærmen viser, i den første række, sandsynligheden for at opnå ægte positiver (TP eller sande NSN) og falske positiver (FP eller falsk NSN) for NSN og SN oocytter, henholdsvis; i stedet, i den anden række, sandsynligheden for at få falske negativer (FN eller falsk SN) og sande negativer (TN eller sande SN) til NSN og SN oocytter, henholdsvis. - Bruge formlen: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), til at beregne FANN nøjagtighed, udtrykt som en procentdel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser en repræsentativ udviklingshæmmede kompetente og inkompetente oocyt, henholdsvis i begyndelsen (GV) og på IVM procedurens afslutning (MII). IVM af fuldt udvokset mus oocyter opstår under 15 h kultur. Time-Lapse observation registrerer progression af meiose og registrerer store meiotiske begivenheder, herunder GVBD og ekstrudering af første polar kroppen.
Analyse og sammenligning af mere end to - hundrede udviklingshæmmede kompetente vs inkompetente oocyter viste tidsforskelle i progressionen af meiose. Specifikt, i NSN oocytter, er GVBD betydeligt forsinket 1-2 time-lapse billeder, mens PB1 ekstrudering opstår med en 15 frames forsinkelse. Trods disse forskelle er variationen for højt til at tillade single-oocyt klassificering. Af denne grund, blev proceduren gennemført med en matematisk klassificering værktøj.
Figur 3 viser en ordning af værktøjet matematiske klassificering anvendes, navngivne Feed-forward kunstige neurale netværk (FANN). For hver oocyt fodret gennem, giver FANN samtidig sandsynligheden for, at gamet er en udviklingsmæssig kompetente og sandsynligheden for, at det er en inkompetent oocyt. I vores forsøg klassificeret FANN mus oocyter med en gennemsnitlig nøjagtigheden af 91.03%.
Figur 1 . Repræsentative SN og NSN oocyter farves med Hoechst 33342. Efter isolering og farvning med fluorokrom Hoechst 33342, fuldt udvokset oocyter klassificeres enten som omgivet nucleolus (SN) (A) eller ikke omgivet nucleolus (NSN) (B), afhængig af tilstedeværelse (pil) eller fravær, henholdsvis, af en ring af Hoechst-positive heterochromatin omkring nucleolus. Skalalinjen: 5 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Partikel billede Velocimetri analyse af Time-Lapse billeder. Resultaterne af PIV analyse er vist nedenfor lysfelt billede for hver af de 113 time-lapse rammer analyseret. Figuren viser begyndelsen (GV) og slutningen (MII) af indspilningsprocessen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Skematisk fremstilling af Feed-forward kunstige neurale netværk. FANN er det matematiske værktøj bruges til at klassificere oocyter som udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere vigtige skridt man skal tage sig af mens de udfører denne protokol med musen oocytter, samt de af andre arter. Når isoleret fra deres follikler, oocyter bør være umiddelbart overføres til optagelse dråber, som adskillelsen fra følgesvend cumulus celler udløsere i begyndelsen af GV at MII overgangen. En eventuel ændring af denne protokol kunne være tilsætning af 3-isobutylmethacrylat-1-Methylxanthin (IBMX) til M2 medium anvendes til p-piller isolation. IBMX forhindrer omgående udløsning af GV at MII overgangen og tillader en synkronisering af den hele eksperimentelle gruppe af oocytter.
Den levende celle-screening system anvendes i vores forsøg (Se Tabel af materialer) begrænser antallet af modning falder til 4 med 4 oocyter pr drop, således at ialt 16 oocyter pr. eksperiment. Denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af andre time-lapse levende celle-screening systemer, kommercielt tilgængelige og udstyret med flere kultur kamre.
Baseret på vores erfaringer, er optagelse intervallet mellem en ramme og det følgende et kritisk punkt. Efter en række foreløbige eksperimenter tog vi billeder hver 8 min fordi dette var vinduet minimumstid, der tillod klart observation af de større begivenheder under GV at MII overgangen, som germinal vescicle opdeling og ekstrudering for det første polar organ. Dette tidsvindue skal måske være revaluated når observere oocytter af andre arter.
En ulempe ved denne metode er kulturen af oocytter i mangel af deres omgivende cumulus celler, som sidstnævnte er kendt for at forbedre yderligere GV at MII overgangen. Til denne henvisning, er vores laboratorium nu teste en mindre ændring af indberettede protokollen ved at inddrage kulturen af cumulus-fri oocyter på en cumulus celler feeder lag.
I sagens natur FANN har et fast antal både input (antal analyserede CMV moduler) og output (enten en udviklingsmæssig kompetente eller inkompetente oocyt) neuroner, men antallet af skjulte neuroner er valgt af investigator gennem en retssag og korrektion tilgang til at opnå den bedste forudsigelse ydeevne. I vores tilfælde, vi eksperimenterede med forskellige antal skjulte neuroner og konstaterede, at tre gav de bedste resultater. FANN analyser kræver også et stort antal input data (i vores eksperimenter 112 CMV moduler) for at få et robust statistikker. En mulig forbedring, der kunne reducere antallet af nødvendige inputdata er anvendelsen af alternative klassificering værktøjer, såsom støtte vektor maskine, træ-taske eller KNN klassificeringer. Når FANN analyse viser dens robusthed, kunne trin 1 blive elimineret fra proceduren.
Denne protokol, sat op til musen, kan testes på oocytter af andre arter, herunder mennesker. Derudover indspille kombination af time-lapse med PIV og neurale netværk analyse kunne udnyttes til observation af CMVs i zygotes10,11 og præimplantations embryoner til vurdering af deres yderligere udviklingsmæssige potentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev gjort mulig takket være støtte af: universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014 2016; og Kinesis for at levere plasticware nødvendigt at gennemføre denne undersøgelse. Vi takker Dr. Shane Windsor (Fakultet, University of Bristol, UK) for at give Cell_PIV software.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
