秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突和细胞内运输的良好模型。在此，我描述了一种实验方案 体内 轴突内运输与鞭毛内运输的记录与分析 秀丽隐杆线虫.
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本文内容
摘要
摘要
轴突运输和纤毛内运输（IFT）对轴突和纤毛的形态发生及功能至关重要。驱动蛋白超家族蛋白和动力蛋白分别为介导顺向和逆向运输的分子马达。这些马达以微管网络作为运输轨道。 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种研究轴突运输和IFT的有力模式生物 体内. 本文描述了一种在活体中观察轴突运输和纤毛内运输（IFT）的实验方案 秀丽隐杆线虫通过使用绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白标记货物蛋白，可实现运输中货物的可视化观察。 秀丽隐杆线虫 是透明的，且可在细胞特异性启动子驱动下于特定细胞中表达GFP标记的货物蛋白。活体线虫可通过微珠固定在10%琼脂糖凝胶上，无需杀死或麻醉线虫。在此条件下，可直接在活体线虫的轴突和纤毛中观察货物蛋白的运输过程 秀丽隐杆线虫 无需解剖。通过改造目标蛋白和/或其表达的细胞，该方法可应用于在任何细胞中观察任何货物分子。参与轴突运输和IFT的大多数基本蛋白，例如分子马达和衔接蛋白，在进化上是保守的 秀丽隐杆线虫与其他模式生物相比，突变体在其中更易于获得和维持 秀丽隐杆线虫. 将该方法与多种 秀丽隐杆线虫 突变体有助于阐明轴突运输和纤毛内运输的分子机制。
引言
活细胞成像技术是分析细胞内运输过程的重要工具。在神经细胞生物学中，利用活细胞成像对轴突运输进行分析，对于理解神经元功能和形态发生至关重要1。轴突运输的缺陷与多种神经退行性疾病密切相关2。驱动蛋白超家族蛋白和动力蛋白分别负责轴突运输的顺向（anterograde）和逆向（retrograde）运输1,2。
纤毛是微管网络和运输机制高度发达的另一类细胞区室3蛋白质合成机制并不存在于纤毛内，这意味着纤毛蛋白必须从细胞质运输至纤毛顶端。一种纤毛特异性的驱动蛋白和动力蛋白，分别称为kinesin-2和细胞质dynein-2，负责运输纤毛的组成成分4，这一现象称为鞭毛内运输（intraflagellar transport, IFT）5. IFT功能受损会导致一组称为纤毛病的疾病6因此，通过活细胞成像分析IFT机制对于理解纤毛形成的基本机制及疾病发生过程至关重要。
Caenorhabditis elegans（
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方案
1. 样品制备
- 使用转基因方法生成感兴趣的 C. elegans 转基因品系18。或者，从 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）获取合适的品系。为观察突触小泡前体的轴突运输，使用转基因品系 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3]7。为观察纤毛内运输（IFT），获取转基因品系 mnIs17 [osm-6::gfp]19。本方案中将使用这些品系。
注意：可采用染色体外阵列、基因组整合，甚至 GFP 基因敲入的方式。为降低背景信号，建议使用细胞特异性启动子，而非泛神经元启动子。
注意：线虫的培养方法在其他方案中有详细描述20。品系在含有 Escherichia coli OP50 食物菌的线虫生长培养基（NGM）平板上（1.7% (w/v) 琼脂糖，50 mM NaCl，0.25% (w/v) 蛋白胨，1 mM CaCl2，5 mg/mL 胆固醇，25 mM KH2PO4，1 mM MgSO4，置于直径 60 mm 的塑料培养皿中）于 20 °C 下维持....
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结果
DA9神经元中的轴突运输
使用 wyIs251 在一条线上，可以同时记录DA9运动神经元中GFP::RAB-3的顺向和逆向轴突运输。DA9神经元近端背侧轴突中顺向和逆向运输的平均速度约为1.8和 2.6 μm/s分别22移动囊泡的数量约为每0.03和0.018个 μm 每秒轴突数量。因此，对于30秒的观察 10 μm 使用100倍镜观察DA9轴突时，可在轴突中观察到约9个和5个移动的囊泡图4 和 视频 1）。如果无法观察到囊泡运动，可能是激光功率过弱。除了长距离运行外，还可以记录囊泡池的短距离运动（视频 1一些囊泡停留在这些囊泡池中，而另一些则从其中解离7,23这些参数可用于监测并分析突变体表型。
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讨论
现有方法的局限性
本文所述方法经过优化，适用于观察轴突运输和纤毛内转运（IFT）等快速事件。因此，固定效果优先于长时间孵育。尽管我们已能够在无明显干扰的情况下持续观察至少20分钟的运输过程，但该方法并不总是适用于需要更长时间观察的缓慢事件，例如轴突伸长和细胞迁移。对于更长时间的观察，需通过降低琼脂糖浓度（即增加含水量以避免干燥，并减少可能造成损伤的压力）来优化实验条件。或者，可采用上述微流控装置15，或使用琼脂糖垫结合麻醉剂固定线虫的方法可能更为合适16，但应仔细评估其潜在的副作用。
方案中的关键步骤
为了实现充分的观察，标记物至关重要。标记物需要被整合到囊泡或颗粒中，并具有足够的亮度。可使用染色体外阵列或整合品系。在DA9神经元中观察突触囊泡前体的轴突运输时，wyIs251品系非常有用7,<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者衷心感谢东北大学的Asako Sugimoto博士提供的有益讨论。wyIs251由斯坦福大学的Kang Shen博士慷慨惠赠。mnIs17由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。本研究得到了日本学术振兴会科研费（#17H05010和#16H06536）、第一三共基金会、脑科学基金会以及内藤基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 载玻片（76 x 26 mm | Matsunami | S1111 | |
| 盖玻片（22 x 40 mm | Matsunami | C024401 | |
| 琼脂糖 | 和光 | 318-01195 | |
| 0.1 微米聚苯乙烯微珠 | Polysciences | #00876 | |
| 加热块 | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| 显微镜 | 奥林巴斯 | IX-71 | 宽场显微镜 |
| 旋转盘扫描仪 | 横河 | CSU-X1 | 转盘共聚焦扫描仪 |
| 数码CCD相机 | 滨松光子学 | C10600-10B | ORCA-R2 数字CCD相机 |
| 物镜（×100，NA 1.4） | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| 巴斯德吸管（5 英寸） | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| 玻璃管（直径 1.5 cm × 长 10.5 cm） | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Kang Shen 实验室 | N/A | |
| OTL11 mnIs17 | 参考文献 27，29 | N/A | SP2101 与野生型回交 6 次 |
| 体视显微镜 | 卡尔·蔡司 | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| 镜面透照装置 | 卡尔·蔡司 | 435425-9010-000 | |
| 铂丝（0.2 mm） | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm 塑料培养皿 | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| 线虫生长培养基（NGM） | 1.7% (w/v) 琼脂糖，50 mM NaCl，0.25% (w/v) 蛋白胨，1 mM CaCl₂，5 mg/mL 胆固醇，25 mM KH₂PO₄，1 mM MgSO₄ |
参考文献
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N En....
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