人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞移植视网膜大眼模型的地理萎缩

Summary

视网膜色素上皮细胞可作为晚期相关黄斑变性的细胞替代疗法。该协议描述了大眼睛的地理萎缩模型的产生和人类胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞视网膜移植到这种疾病模型。

Abstract

地理萎缩 (GA), 晚期与干年龄相关的黄斑变性的特点是失去视网膜色素上皮 (RPE) 层, 这导致后退化的重要视网膜结构 (如, 光) 导致严重视力损害。类似地, 视网膜色素上皮的丧失和视力减退见于长期随访的晚期与湿性黄斑变性 (AMD) 接受玻璃抗血管内皮生长因子 (VEGF) 治疗的患者。因此, 一方面, 这是至关重要的有效地从一个无限的来源, 可以作为替代治疗的视网膜色素上皮细胞。另一方面, 重要的是要评估的行为和整合的模型中衍生细胞的疾病所涉及的外科和影像学方法尽可能接近于那些应用于人类。在这里, 我们提供了一个详细的协议的基础上, 我们以前的出版物, 描述了使用白化兔眼的 GA 前体细胞的生成, 用于评价人类胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞 (干细胞-RPE) 在临床相关的设置。分化干细胞-RPE 被移植到天真的眼睛或眼睛与 NaIO₃诱导的 GA 样视网膜变性使用25克 transvitreal 部扁平技术。采用多模态高分辨率非侵入实时成像技术对退化和移植区进行评价。

Introduction

该协议描述了一种大眼睛的地理萎缩 (GA) 的临床前模型的产生, 允许评价移植干细胞-RPE 在视网膜空间的整合。本文详细介绍的方法已在3份最近的出版物中使用, 它们展示了干细胞¹的视网膜色素上皮细胞的丰富、纯净和功能性种群的产生, 以及产生外视损伤和类似 GA 的表型由视网膜注射的生理盐溶液 (即, BSS 和 PBS) 或 NaIO₃在兔子眼中^2,3。我们进一步证明, 亚视网膜悬吊移植的干细胞-RPE 形成广泛功能单分子膜与感光剂抢救能力²。

利用兔眼的几个优点来产生一种 GA 模型的疾病。首先, 兔眼的大小, 这是70% 的成人眼睛的体积, 允许临床有意义的移植使用的细胞密度远远低于常规使用的小鼠眼 (1000 细胞/µL vs. 5万细胞/µL)^4,5. 其次, 啮齿类动物的手术通常是通过脉络膜巩膜的, 这会损害视网膜屏障, 并可能引发炎症反应和可能的拒绝⁶。这两个因素一起可能导致移植细胞的多层和结块, 以及移植细胞在一个被破坏的本地视网....

Protocol

下面的协议遵循卡 Instituet 的动物保育指南。所有使用新西兰白化兔的动物实验 (材料表) 已得到区域动物伦理委员会 (召开 Norra Djurförsöksetiska Nämnd) 的批准 (许可证: dnr 56/15)。使用干细胞 (dnr 2011/745-31/3) 和干细胞-RPE (dnr 2013/813-31/2) 的转让和操纵也符合瑞典立法和卡学院条例, 并已得到区域人类伦理委员会的批准 (Regionala Etikprövningsnämnden 我斯德哥尔摩)。

1. 视网膜注射碘酸钠 (NaIO₃) 成大眼动物模型

1. 麻醉动物通过肌肉注射在大腿与35毫克/千克氯胺酮和5毫克/千克嗪在盐水中使用30克注射器, 并扩大学生的局部眼药液使用混合0.75% 喷和2.5% 肾上腺素。如果动物对其后腿的硬捏没有反应, 适当的麻醉被证实。
2. 将兔子置于外科显微镜下, 头部朝向外科医生 (图 1A)。使用盖子牵引器去除眼睑和 nictitans 膜与无菌布, 以尽量减少污染的风险。使用平衡盐溶液 (BSS), 以防止在两眼麻醉时干燥。
3. 对于显微外科, 使用2端口 (或可选3端口) 25 克 transvitreal 部扁平技术与非瓣套管插入显微外科仪器 (

Results

在图 2中显示了典型的活体图像, 如生物滤池、IR-cSLO 和正常白化兔视网膜的 SD OCT。注意不同的视网膜层与他们的独特水平的光反射捕获的 SD OCT 仪器。

在数字 1A和图 1B中, 创建子视网膜泡的设置如下所示: 一个盖子牵引器定位, 使眼睛的盖子, 允许插入3套管 (图 1B) 1-2 毫米远离角膜缘, 为了避免透镜触摸, 并在30-45 ˚的平行角。套管将使引进一个可选的输液套管, 除了一盏灯, 和注射针通过巩膜。在手术过程中, 瞳孔放大和平板接触镜可以促进眼底和亚视网膜空间的视线。

Discussion

在本协议中, 对遗传算法的大眼模型的生成及其在评价干细胞-RPE 积分中的临床应用进行了描述。

为了将 GA 及相关疾病的再生疗法翻译为临床⁷, 必须开发和优化方法, 以忠实地捕获移植和影像学的临床方法。兔子在这方面有吸引力: 它有一个相对较大的眼睛, 允许眼内手术和标准成像的使用, 是便宜和容易安置相比, 其他大眼睛动物。

我们描述使用标准的 transvitreal 25 规范的玻璃体切除技术, 创造的亚视网膜泡或诱导亚视网膜损伤或移植干细胞-RPE。最初, 我们使用了一个3端口设置, 如图 1B所示, 目的是使用输液口 (套管针), 以防在手术过程中进行玻璃体切除手术。然而, 由于我们没有发现玻璃体切除术是必要的应用亚视网膜注射, 输液口已被省略。然而, 第三个港口的选择应保留, 如果该程序是进一步调整和玻璃体切除手术。

大眼兔是一个建立良好.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NutriStem hESC XF 分化培养基 –bFGF 和 –TGFb	生物工业	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco，ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+	Gibco，ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
细胞过滤器 40 &μ;m 尼龙	VWR	732-2757
针 30 G 0.5'’;0.3 mm x 13 mm	BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm 注射器过滤器	Acrodisc	PN4612
0.4% 台盼蓝	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	在 0.2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% 乙醇	SolvecoAB	1047
氯胺醇，100 mg/mL	中间体，Boxmeer	511519	使用 35 mg/kg 氯胺酮
Rompun vet，20 mg/mL	拜耳动物保健	22545	使用 5 mg/kg 甲苯噻嗪
三分液，40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	2 mg 玻璃体内注射
Cyklopentolat-phenylephrine，0.75% + 2.5%	APL	321968	每只眼睛
Viscotears	Laboratoires Théa	597562
外用盐水	Apotea AB	7053249369080
Allfatal 兽医。100 mg/mL	Omnidea	77168	使用 100 mg/mL 戊巴比妥
延长管（锤子）	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G 多头视网膜下插管	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
一次性使用平面晶状体	Volk
Barraquer Colibri 盖子牵开器	AgnTho's AB	42-020-030
无阀穿刺器	Alcon Nordic A/S	8065751448
带爪镊子	Bausch &Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS 玻璃体切除术机	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge 玻璃体切除术 TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT 设备	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	使用 Heidelberg Eye Explorer 版本 1.9.10.0
24 孔板	Sarstedt	83.3922
Neubauer 血细胞计数器	VWR	631-0925
新西兰白化兔	Lidköpings 瑞典
hESC-RPE 细胞			见参考编号 1
>Buprenodale Vet，0.3 mg/ml	Dechra	660500	皮下注射使用 0.5 mL 丁丙诺啡