지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식
Summary
망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.
Abstract
지리적 위축 (GA), 건조 연령 관련 황 반 변성의 늦은 단계는 망막 안료 상피 (RPE) 계층, 중요 한 망막 구조 (예를 들면, 대뇌)의 후속 퇴보로 연결의 손실에 의해 특징은 발생 심한 시력 장애입니다. 마찬가지로, RPE 손실 및 시력 감소는에서 보인다 장기 따라 최대 intravitreal 항 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 치료를 받고 고급 젖은 연령 관련 황 반 변성 (AMD)과 환자의. 따라서, 한편으로, 그것은 근본적인 RPE 세포 대체 요법으로 사용할 수 있는 무제한 소스에서 효율적으로 파생. 다른 한편으로, 동작 및 질병 반하는의 모델에서 파생 된 셀의 통합 수술을 평가 하는 것이 중요 하다 고 이미징 방법으로 인 간에 적용 된 수로 닫습니다. 여기, 우리 제공 조지아의 전 임상 모델의 생성을 설명 하는 우리의 이전 간행물에 따라 상세한 프로토콜 흰둥이 토끼 눈을 사용 하 여 인간 배아 줄기 세포의 평가 파생 된 망막 색소 상피 세포 (hESC-RPE) 대에 임상 관련 설정입니다. 차별화 된 hESC RPE는 순진한 눈 또는 NaIO3눈에 이식-25 G transvitreal 동위 플 기술을 사용 하 여가 같은 망막 변성을 유도. 퇴 화와 이식 분야의 평가 복합 고해상도 비-침략 적 실시간 이미징에 의해 수행 됩니다.
Introduction
이 프로토콜 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE의 통합의 평가 허용 하는 지리적 위축 (GA)의 큰 눈이 전 임상 모델의 생성을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 hESC1, 외부 망막 손상 및 GA 같은 표현 형의 창조에서 RPE 세포의 풍부한, 순수, 고 기능 인구 생산을 보여 주는 3 최근 출판물에 사용 된 생리 소금 솔루션 (즉, BSS와 PBS) 또는 토끼 눈2,3NaIO3 의 subretinal 주입에 의해 유도. 우리 hESC RPE의 하위 망막 정지 이식 포토 리셉터 구조 용량2광범위 한 기능 monolayers 형태로 입증 되었습니다.
몇 가지 장점이 동반 질병의 조지아 모델의 생성에 대 한 토끼 눈의 사용. 첫째, 크기 토끼 눈의 70%는 성인 인간의 눈의 볼륨은, 일상적으로 사용 하는 작은 설치류 눈 (1000 셀 / µ L 대 50, 000 셀 / µ L)4 보다 훨씬 낮은 세포 밀도 사용 하 여 임상적으로 의미 있는 이식 수 , 5. 둘째, 설치류에 수술은 일반적으로 맥락 막의, 망막 장벽을 타협 하 고 잠재적으로 염증 반응과 가능한 거부6을 통해 transscleral. 두 요소는 함께 multilayering와 이식된 세포와 방해 네이티브 망막 조직에 이식된 세포의 전반적인 가난한 통합의 응집을 발생할 수 있습니다. 그러나, 큰 눈 토끼 모델 계측 임상 설정으로 동일과 수술 기법을 수행할 수 있습니다. 셋째, 눈이 큰 모델도 고해상도 허용 vivo에서 이미징 및 이식된 세포와 시간1,2,3overlying 망막의 모니터링 합니다. 따라서, 우리는 정상 및 병에 걸리는 망막과 망막 하 공간의 연구에 관심을 가진 사람에 대 한 설치류에 매력적인 대안이 되어야 임상적으로 적절 하 고 비용 효율적인 전 임상 모델을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 hESC RPE 통합에서 vivo에서 평가 대 한 조지아와 그것의 임상 사용의 눈이 큰 모델의 생성을 설명 합니다.
번역에 대 한 재생 치료의 조지아 및 관련된 질병에 대 한 클리닉7에, 그것은 개발 하 고 충실 하 게 이식 및 이미징에 대 한 임상 메서드를 캡처하는 방법을 최적화 하는 것이 중요. 매력적인이 측면에서 토끼가: 비교적 큰 눈 안 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 시각 장애, 안과 연구, 스웨덴 눈 재단, 임금 Gustav V 재단, ARMEC는 에드윈 요르단 재단 재단법인 크라운 공주 Margareta 카롤 린스 카 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다 Lindeberg 재단, 그리고 Cronqvist 재단입니다.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
