复杂性 体内 系统使得区分 Notch 受体的激活与抑制变得困难 转- 和 顺式-配体。在此，我们介绍一种基于 体外 用于定性与半定量评估结合能力的细胞聚集实验 果蝇 Notch 到 转-配体与 顺式-配体。
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摘要
摘要
Notch 信号通路是一种在进化上保守的细胞间通讯系统，广泛参与动物的发育过程及成体组织的维持。当 Notch 受体与邻近细胞上的配体相互作用时，可诱导该信号通路的激活。转-活化），而与同一细胞上的配体相互作用则会抑制信号传导（顺式-抑制）。适当的平衡 转-激活和 顺式-抑制有助于在动物发育的某些情况下建立最佳的Notch信号水平。由于Notch与其配体在多种细胞类型中存在表达区域的重叠以及反馈机制的存在，研究特定翻译后修饰对 转- 与 顺式Notch 及其配体的相互作用 体内 很困难。在此，我们描述了一种使用 果蝇 S2 细胞在细胞聚集实验中用于评估敲低 Notch 信号通路调控因子对 Notch 与各配体结合的影响 转 以及在 顺式稳定或瞬时转染表达Notch载体的S2细胞与表达各Notch配体的细胞（S2-Delta或S2-Serrate）混合。 转录受体与配体结合导致异型细胞聚集体的形成，其结果以每毫升中由...组成的聚集体数量来衡量 >6 个细胞。为检测抑制作用 顺式-配体，共表达Notch和每种配体的S2细胞与S2-Delta或S2-Serrate细胞混合，聚集体数量的定量方法如上所述。由于存在该配体导致的聚集体数量相对减少程度 顺式-配体提供了一种度量方法 顺式配体介导的抑制作用 转-结合。这些简单的实验可提供关于基因或药物干预对Notch与其配体结合影响的半定量数据，并有助于解析潜在的分子机制 体内 此类操作对 Notch 信号通路的影响。
引言
经典的Notch信号通路是一种短程的细胞间通讯机制，需要相邻细胞之间的直接接触，以促进Notch受体与其配体之间的相互作用1。Notch受体（位于信号接收细胞表面）与配体（位于信号发送细胞表面）之间的相互作用启动Notch信号通路，该过程被称为反式激活2。相反，Notch与其配体在同一细胞内的相互作用则会抑制Notch通路，被称为顺式抑制3。反式与顺式相互作用之间的平衡对于确保配体依赖性的最佳Notch信号传导至关重要4。Drosophila仅具有一个Notch受体和两种配体（Delta和Serrate），而哺乳动物则具有四个Notch受体和五种配体［Jagged 1（JAG1）、JAG2、delta样1（DLL1）、DLL3和DLL4］5。由于这种简单性，Drosophila模型便于解析或研究通路调节因子对Notch-配体相互作用以及后续Notch信号通路的影响。在动物发育过程中的某些情况下（包括Drosophila的翅发育），顺式和反式相互作用均参与实现适当的Notch信号传导和细胞命运决定1
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方案
1. 用于 Shams 基因沉默的双链RNA（dsRNA）的制备
- PCR扩增产物
- 使用野生型 黄色 白色 (y w基因组DNA和 pAc5.1-EGFP 以该模板和以下引物对扩增用于合成dsRNA的DNA片段。采用以下PCR扩增程序：变性（95 °C，30 s）、退火（58 °C，30 s）和延伸（72 °C，1 min）。
增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) dsRNA 引物（5'-3'）-
上游引物 - GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
反向引物- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
Shams dsRNA 引物（5'-3'）-
上游引物- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
反向引物- TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
注意： EGFP dsRNA 用作阴性对照。
- 使用野生型 黄色 白色 (y w基因组DNA和 pAc5.1-EGFP 以该模板和以下引物对扩增用于合成dsRNA的DNA片段。采用以下PCR扩增程序：变性（95 °C，30 s）、退火（58 °C，30 s）和延伸（72 °C，1 min）。
- 使用商品化的凝胶回收试剂盒，按照生产商提供的操作说明对聚合酶链式反....
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结果
我们的 体内 观察表明，木糖基转移酶基因的缺失 假手术组 导致Delta介导的Notch信号通路激活增强 转- 在不影响的情况下激活 Notch cis-配体介导的 Notch 抑制8为了验证这一观点， 体外 细胞聚集实验已进行。首先， 假手术组 在S2细胞中通过使用...实现表达敲低 假手术组 dsRNA EGFP 以dsRNA作为对照。通过实时PCR检测基因敲低（KD）效率，结果显示效率高于80%8然后，Notch受体与 转通过聚集实验检测sham KD后Delta的变化。在S2-Notch细胞与S2-Delta细胞混合后的不同时间点检测其聚集情况。以普通S2细胞与S2-Delta细胞之间的聚集作为背景对照。 图3 显示混合后不同时间点（1、5、15 和 .......
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讨论
经典的Notch信号通路依赖于Notch受体与其配体之间的相互作用5。尽管大多数关于Notch通路的研究主要关注相邻细胞间Notch与配体的结合（trans），但Notch也能与同一细胞内的配体发生相互作用，这类所谓的cis相互作用可在Notch信号传导中发挥抑制作用3,4。因此，为了阐明某种调控因子对经典Notch信号通路影响的机制，通常有必要同时研究这两种类型的Notch-配体相互作用（trans和cis）。然而，在动物发育的许多情况下，这两种相互作用及其反馈调控的共同参与使得体内（in vivo）研究变得复杂1,6。在本实验方案中，我们提供了一种详细的体外（in vitro）细胞聚集实验方法，利用果蝇（Drosophila）S2.......
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致谢
作者感谢美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目号 R01GM084135，授予 HJN）和水谷糖科学基金会（Mizutani Foundation for Glycoscience，资助号 #110071，授予 HJN）提供的支持，并感谢 Tom V. Lee 在实验方法方面的讨论和建议，同时感谢 Spyros Artavanis-Tsakonas、Hugo Bellen、Robert Fleming、Ken Irvine 以及果蝇基因组资源中心（Drosophila Genomics Resource Center, DGRC）提供质粒和细胞系。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BioWhittaker Schneider’果蝇培养基，改良型 | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone 青霉素-链霉素 100X 溶液 | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 孔板 | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 孔板 | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR迷你摇床 | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific | 267110 | |
| FuGENE HD 转染试剂 | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 转录试剂盒 | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep（RNA纯化试剂盒） | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision 倒置显微镜 | VWR | ||
| 9MP USB2.0 显微镜数字相机 + 高级软件 | AmScope | MU-900 | 使用 ToupView 软件进行图像采集 |
| PureLink 快速凝胶回收试剂盒 | Invitrogen | K210012 | |
| 胎牛血清 | GenDepot | F0600-050 | |
| 甲氨蝶呤 | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| 潮霉素B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| 硫酸铜 | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2细胞 | Invitrogen | R69007 | |
| S2-Serrate汤姆 细胞 | R. Fleming 惠赠（Fleming 等，Development，2013） | ||
| S2-Delta 细胞 | 果蝇基因资源中心 | 152 | |
| S2-Notch细胞 | 果蝇基因资源中心 | 154 | |
| pMT-Delta 载体 | 果蝇基因组资源中心 | 1021 | S. Artavanis-Tsakonas 惠赠 |
| pMT-Serrate 载体 | Ken Irvine 惠赠（Okajima 等，JBC，2003） | ||
| pMT-Notch 载体 | DGRC | 1022 | S. Artavanis-Tsakonas 惠赠 |
| pAc5.1-EGFP | Hugo Bellen 惠赠 | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-步骤 试剂盒 | 应用生物系统 | 1611091 | |
| CG9996（Shams）TaqMan 基因表达检测 | 应用生物系统 | Dm02144576_g1 | 使用 FAM-MGB 染料 |
| CG7939（RpL32）TaqMan 基因表达检测 | 应用生物系统 | Dm02151827_g1 | 使用 FAM-MGB 染料 |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR 系统 | 应用生物系统 | 4351405 | 96孔板模块 |
参考文献
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E.
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