一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

摘要

本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。

摘要

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能的激素。胰岛主要由五种分泌激素的细胞组成：α细胞分泌胰高血糖素，β细胞分泌胰岛素，δ细胞分泌生长抑素，ε细胞分泌饥饿素，PP细胞分泌胰多肽。胰岛中60%至80%的细胞为β细胞，是研究胰岛素分泌最重要的细胞群体。胰岛是研究离体胰岛素分泌的关键模型系统。获取高质量的胰岛对糖尿病研究至关重要。大多数胰岛分离方法需要在胶原酶注射位点进行技术难度较高的操作，涉及剧烈且复杂的消化过程，以及多次密度梯度纯化步骤。本文介绍一种操作简便、得率高的小鼠胰岛分离方法，提供详细的描述和真实演示，具体步骤如下：1）在法特壶腹（连接胰管与胆总管的一个小区域）注射胶原酶P；2）通过酶消化和机械分离法去除外分泌胰腺组织；3）单次梯度纯化步骤。该方法的优势在于利用更易接近的法特壶腹进行消化酶注射，结合酶消化与机械分离实现更彻底的组织消化，并采用更简单的单梯度纯化步骤。本方案每只小鼠可获得约250—350个胰岛，所得胰岛适用于多种离体研究。该操作可能存在的局限性包括酶消化或梯度孵育时间过长可能导致胰岛损伤，但通过谨慎控制并合理调整孵育时间，这些问题在很大程度上可以避免。

引言

文献中报道了两种常见的胰岛分离方法。一种方法需要切除胰腺，并用手术剪将其剪切成小块，然后在胶原酶溶液中进行消化^1,2,3。另一种更为精确的方法是利用胰腺中存在的导管网络将消化酶引入组织。以下部位已被用于注射消化酶：胆管与胆囊管的汇合处、胆囊至胆总管，或直接注入胆总管本身^1,4,5。已知胰岛在胰腺中的分布并不均匀，其中脾脏区域含有最多的胰岛⁶。尽管通过解剖通路递送消化酶的第二种方法能够实现对胰腺（包括脾脏区域）更完整的灌注，但该操作通常需要夹闭或缝合技术上较具挑战性的法特壶腹。在胰岛纯化方面，已采用多种密度梯度、细胞筛以及磁性分离技术来纯化胰岛^3,7。使用这些梯度的方法可能耗时较长，且Ficoll梯度可能对胰岛造成毒性损伤⁸。

本方案基于Li等⁷所述方....

方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯农工大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准&M 大学。所需手术工具如图所示 图1 该操作流程的示意图如下所示 图2.

1. 溶液

1. 通过将100 mL 10X HBSS（来自储备液）加入900 mL蒸馏水中，配制1 L 1X HBSS（Hank’s平衡盐溶液）。
2. 通过将50 mL 100X胎牛血清（FBS）加入450 mL冰浴的1X HBSS中，配制STOP溶液（必须现配，并在1小时内使用）；此操作可制备500 mL STOP溶液。将STOP溶液保存在4 °C。
3. 通过将1 mg/mL胶原酶P加入冰浴的1X HBSS中，配制胶原酶P溶液（必须在使用前1小时内新鲜配制）；每只小鼠使用6 mL。
   1. 向胶原酶P溶液中添加0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）（为分离的胰岛提供营养）。例如，在6 mL胶原酶P溶液中加入3 mg BSA。保持在冰上。
   2. 计算并准备所有小鼠所需的胶原酶P总量，置于一个50 mL离心管中。
4. 通过向含5.5 mM葡萄糖的500 mL RPMI 1640培养基中添加10% FBS、100 U/mL青霉素、....

结果

正确完成该操作需要对小鼠腹腔内的解剖结构有一定了解，以便准确识别法特壶腹并夹闭胆总管。整个操作通常需要1–2小时。同时从4–6只小鼠中分离胰岛效率更高，这样可将多个样本一起进行离心。挑取胰岛所需时间因胰岛数量和消化效率而异；从1只小鼠中挑取250–350个胰岛大约需要1小时。

本文包含多张非常逼真的图像：图3 显示了小鼠的腹腔，暴露出胆总管和肝动脉。图4 显示了胆总管的全长，其颜色较浅，以及瓦特壶腹（Vater ampulla），在胰腺与十二指肠交界处（即针头插入位置）附近更为膨大且有光泽。在靠近肝脏处的胆总管与肝动脉束上放置一个夹子，以阻止胶原酶P流入肝脏。若胆管夹闭不正确或不够紧密，将导致泄漏，从而造成胰腺灌注不完全。图5 显示针头插入瓦特壶腹并进入胆总管。一旦针头进入胆总管，需使用镊子固定针头，防止其在注射过程中刺穿胆管。注射开始后，胰腺将从近端向远端逐渐肿胀；注入约1 mL胶原酶后，脾脏区域应开始.......

讨论

本方案包括胶原酶灌注与消化，随后进行胰岛纯化。该方案最关键的步骤是对胰腺进行有效的注射和完全的灌注^1,4,7。本方案的递送方法可使酶沿解剖路径运行，从而更有效地消化胰岛周围的外分泌组织¹。此外，该技术特别适用于脾部区域的完全消化，该区域胰岛浓度最高^4,6。通过严格控制消化时间并仔细执行纯化步骤，本方案可获得250–350个健康的胰岛。采用本方案分离的胰岛已成功用于离体研究葡萄糖刺激的胰岛素分泌¹²。根据我们的经验，在含5.5 mM葡萄糖的RPMI-1640完全培养基中过夜孵育后，高葡萄糖刺激（22.2 mM）下的胰岛素分泌量较基础水平（3.3 mM）增加4倍。胰岛在长期孵育（2–7天）条件下的存活能力/功能尚未进行测试。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 注射器	BD	309657	用于盛装胶原酶 P
盖玻片镊子	VWR	82027-396	夹持小鼠皮肤以辅助切口操作
弯头镊子	Sigma-Aldrich	Z168696	在胰腺摘除过程中夹持组织
异氟烷	Piramal	B13B16A	手术前用于麻醉小鼠
100 mm 培养皿	VWR	30-2041	用于胰岛培养
30 G. ½ 英寸针头	BD	305106	用于穿刺壶腹以注入胶原酶 P —— 选用该规格是因为其可良好适配大多数胆总管
50 mL 离心管	VWR	89039-658	用于盛装消化后的胰腺组织、胶原酶 P 及纯化的胰岛
带防水屏障的吸水垫	VWR	82020-845	用于吸收手术过程中的血液
5810R 型离心机，配备摆动桶转子及减速功能	Eppendorf	5811FJ478114	用于沉淀组织，沉淀物形成于锥形管底部 —— 必须使用摆动桶离心机。此外，减速功能对于形成梯度层至关重要
胶原酶 P，1 g	Roche Diagnostics	11249002001	用于消化外分泌胰腺组织
弯头手术剪	Fisher-Scientific	13-804-21	用于剪开小鼠腹腔
解剖显微镜	Olympus	SZX16	用于识别关键解剖结构，以准确将胶原酶注入胰腺
Hank's 平衡盐溶液 10 倍浓缩液	Corning	20-023-CV	用于洗涤细胞
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	用于形成密度梯度
光源	Leeds	LR92240	增强显微镜下的可视性
RNA酶清除剂（RNaseZap）	Fisher-Scientific	AM9780	用于去除RNA酶
不含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Corning	15-040-CV	用于胰岛培养
Schwartz 微型止血钳（微血管夹）	Fine Science Tools	18052-01	用于夹闭胆总管和肝动脉
振荡水浴箱	Boekel/Grant	8R0534008	对胰腺外分泌组织进行机械消化至关重要
小型手术剪	VWR	82027-578	用于剪除附着在胰腺上的组织