本文介绍了一种在小鼠中实现心脏特异性基因操作的实验方案。在麻醉条件下，通过第四肋间切口将小鼠心脏暴露于体外，随后使用注射器将编码特定基因的腺病毒注入心肌组织，接着通过蛋白质表达检测方法进行分析。 体内 成像和蛋白质印迹分析。
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方法文章
一种简单高效的方法 体内 小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
特异性地在心脏中进行基因操作可显著促进对心脏疾病发病机制及其治疗潜力的研究。体内心脏特异性基因递送通常通过全身性或局部递送实现。通过尾静脉进行全身注射，使用重组腺相关病毒9型（AAV9）可简便高效地调控心脏基因表达。然而，该方法需要相对较高剂量的载体才能实现有效转导，且可能导致非靶器官的基因转导。本文介绍一种简单、高效且省时的小鼠体内心脏特异性基因操作方法——心肌内注射。在不进行通气的麻醉条件下，钝性分离胸大肌和胸小肌，通过第四肋间的小切口手动将小鼠心脏快速暴露。随后使用汉密尔顿注射器将编码荧光素酶（Luc）和维生素D受体（VDR）的腺病毒，或靶向VDR的短发夹RNA（shRNA），注射至心肌组织中。后续的体内成像结果显示，荧光素酶在心脏中实现了特异性成功过表达。此外，Western blot分析证实了VDR在小鼠心脏中成功过表达或被有效沉默。一旦掌握该技术，即可用于小鼠心脏中的基因操作，以及细胞或其他材料（如纳米凝胶）的注射。
引言
心脏疾病是全球范围内发病率和死亡率的首要原因1,2。对于心肌梗死和心力衰竭等危及生命的心脏疾病，由于缺乏有效的治疗策略，人们正深入探索其潜在的病理机制，并致力于寻找新的治疗方法3。在这些科学研究中，心脏特异性基因操作被广泛应用4,5。心脏基因操作可通过基因组编辑技术实现，例如利用高效的转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9（Cas9）工具；也可通过递送外源性遗传物质（例如，携带目的蛋白编码基因的病毒载体）来完成6。尽管基因组编辑能够在活体小鼠中实现精确且具有时空特异性的基因组修饰，但该方法仍然耗时较长且劳动强度大6。作为替代方案，通过病毒载体或小干扰RNA（siRNA）复合物递送实现心脏特异性基因操作的方法已被常规采用6。
将病毒载体递送至成年小鼠心脏主要有两种策略：全身注射或局部注射。全身注射嗜心肌型腺相关病毒（如AAV9）可非侵入性地实现心脏特异性基因操作
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方案
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》进行，并经研究所动物伦理委员会批准。所有实验均使用雄性C57BL/6J小鼠（8至10周龄）。小鼠饲养于无病原体环境中，温度为24 °C ± 4 °C，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取水和食物。
1. 腺病毒溶液的制备
- 纯化的腺病毒溶液到达后，将其储存于 -80 °C 冰箱中。
注意：腺病毒注射在活体小鼠中进行。为确保腺病毒载体的无菌性，腺病毒（编码荧光素酶、VDR 或靶向 VDR 的 shRNA）由商业途径制备并纯化9,10。 - 手术当天，从 -80 °C 冰箱中取出纯化的腺病毒溶液（3 x 1010 空斑形成单位 [pfu]/mL），并在冰上解冻腺病毒载体溶液。
- 佩戴口罩、无菌手套和无菌手术服。
- 准备一支已在手术前一天灭菌的 50-µL Hamilton 注射器。
注意：灭菌时，将 Hamilton 注射器用纱布包裹后放入高温高压灭菌器中，选择"固体灭菌"模式，按下"启动"按钮开始灭菌。 - 腺病毒溶液完全解冻后，用 75% 乙醇喷洒含有腺病毒溶液的管子，并将腺病毒溶液转移至超净台中。
- 在超净....
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结果
实验方案及所报道方法的一些关键步骤如下所示 图1在注射编码荧光素酶的腺病毒（Adv-luc）至心肌后第5天 体内 在注射了 adv-luc 的小鼠中进行成像，结果显示荧光素酶在心脏中特异性显著过表达（图2A, B），该结果经蛋白质印迹分析（Western blot）证实（图2C)，提示无非靶器官的转导。相比之下，对照小鼠中未检测到荧光素酶表达。与荧光素酶成功过表达结果一致，Western blot分析显示，注射编码VDR的腺病毒（adv-VDR）的小鼠左心室中VDR表达显著增加图3A）。此外，adv-shVDR 注射显著降低了左心室中的 VDR 表达水平（图3B）。相比之下，在注射了adv-VDR或adv-shVDR的小鼠中，.......
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讨论
本报告介绍了一种改良的心肌内注射病毒载体用于心脏基因操作的技术，该技术是在Gao et al.13报道的诱导心肌梗死方法基础上改进而来。目前，对特定基因功能的体内研究通常依赖于构建基因敲除或转基因小鼠3,14,15,16,17，但此类方法成本高、耗时长且劳动强度大。作为替代方案，通过全身性或局部注射递送基因载体或siRNA也已在心血管研究中广泛应用4,5,7。尤其在某些情况下，心肌内注射在心脏基因操作中具有不可替代性：例如需要靶向特定部位注射时（<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家杰出青年科学基金（81625002）、国家自然科学基金（81470389、81270282、81601238）、上海市学术带头人计划（18XD1402400）、上海市教委高峰临床医学 grant 支持（20152209）、上海申康医院发展中心（16CR3034A）、上海交通大学（YG2013MS42）、上海交通大学医学院（15ZH1003 和 14XJ10019）、上海市扬帆计划（18YF1413000）以及蚌埠医学院研究生创新计划（Byycx1722）的资助。我们感谢高厄和博士（Dr. Erhe Gao）此前在本实验室提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>设备 | |||
| 层流无菌罩 | 丰实动物实验 设备技术有限公司（中国苏州） | FS-CJ-2F | |
| 离心 | 赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆） | 75005282 | |
| 组织研磨机 | 中国宁波 Scientz 生物技术有限公司 | Scientz-48 | |
| 高温高压灭菌器 | 日本埼玉县平山 | HVE-50 | |
| 异氟烷蒸发器 | Matrix（Orchard Park，美国） | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III 成像系统 | PerkinElmer（美国沃尔瑟姆） | CLS136334 | |
| 精确度 天平 | 赛多利斯（Gö德国蒂宾根 | 28091873 | |
| <强>仪器 | |||
| Eppendorf 移液器（100 µL | Eppendorf（美国韦斯特伯里） | 4920000059 | |
| Eppendorf 移液器（10 µL | Eppendorf（美国韦斯特伯里） | 4920000113 | |
| 镊子 | 上海医疗器械（集团）有限公司 | JD4020 | 弯曲尖端 |
| 哈密顿注射器 | 美国，内华达州，汉密尔顿 | 80501 | 第50卷 μL |
| 微型蚊式止血钳 | F.S.T（美国福斯特市） | 13011-12 | 弯曲，尖端宽度 1.3mm |
| 持针器 | 上海医疗器械（集团）有限公司（中国上海） | J32110 | |
| 手术剪 | F.S.T（美国福斯特城） | 14002-12 | |
| 1-mL 注射器 | 中国山东，威高集团医用高分子有限公司 | ||
| <强>材料与试剂 | |||
| 抗GAPDH抗体 | CST（Danvers， 美国 | #2118 | |
| 抗荧光素酶抗体 | Abcam（英国剑桥） | ab187340 | |
| 抗兔IgG | CST（Danvers， 美国 | #7074 | |
| 抗VDR抗体 | Abcam（英国剑桥） | ab109234 | |
| 布托啡诺 | 赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆） | PA175056 | |
| 水合氯醛 | 凌峰化学（中国上海） | ||
| 冻存管 | 赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆） | 375418 | 1.8 mL |
| 脱毛膏 | Veet（中国上海） | ||
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco（美国格兰德岛， 美国 | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang（中国上海） | 310132 | |
| EP管 | Sarstedt（Newton，美国） | PCR001 | |
| 过滤 | 默克密理博（贝德福德，美国） | 孔径 0.2 µm | |
| 异氟烷 | 一品制药有限公司（中国河北） | ||
| 荧光素 | 普洛麦格（美国麦迪逊） | P1041 | |
| 用于 Western 的裂解缓冲液 印迹 | 碧云天（中国上海） | P0013J | 无抑制剂 |
| 眼用软膏 | Apex Laboratories（墨尔本，澳大利亚） | ||
| PBS | Gibco（美国格兰德岛， 美国 | 10010023 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | 赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆） | 78438 | |
| 5-0 丝线缝合线 | 上海医疗器械（集团）有限公司（中国上海） | ||
| 钢球 | 宁波科学生物技术有限公司（中国宁波） | 宽度 1.5 mm | |
| 注射器针头 | 康丽医疗设备有限公司（中国浙江） | 30 号针头 | |
| 加热垫 | 中国广东省，Warmtact电气加热技术有限公司 | NF-GNCW |
参考文献
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重印与许可
