封入体、ミリグラム単位の微量のタンパク質を生成するための精製からカンピロバクター走 Tlp3 の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの巻き戻しプロシージャが表示されます。
化学受容器とリガンド特異性の分子基盤の解明を目指した構造研究の天然リガンドの同定は、大きく純粋な折り畳まれたリガンド結合ドメインの少量の生産によって容易にできます。クローン細菌エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 化学受容器のペリプラズム リガンド結合ドメインをよく表現しようと封入体に彼らをターゲットに発生します。ここでは、封入体、そのリフォールディング、例としてカンピロバクター (c) 受容体 Tlp3 のペリプラズム dCACHE リガンド結合ドメインを用いた精製からタンパク質の回収の手法を提案します。アプローチを含む、劈開を持つ興味の蛋白質の表現彼の6-タグ、分離および尿素を介した脱色封入体タンパク質アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによる尿素の枯渇及び精製リフォールディングタグの取り外しとサイズ排除クロマトグラフィーが続きます。円偏光二色性分光は、純粋な蛋白質の折られた状態を確認する使用されます。このプロトコルは一般的に水溶性と crystallisable フォームで他の細菌の化学受容器の dCACHE ペリプラズム リガンド結合ドメインの少量の生産に有用なそれが実証されています。
細菌の植民地化とホスト1,2,3の侵略を促進することによりカンピロバクターの病因に重要な役割を再生する走化性と運動性が示されています。走化性化学信号によって導かれて細菌の成長のための最適な環境に向かって移動することができます。このプロセスには、化学受容器と呼ばれるタンパク質や探触子のようなタンパク質 (Tlps) のセットによって細胞内および環境化学手掛かりの認識が含まれます。ほとんどの化学受容器は、表層のリガンド結合ドメイン (LBD)、膜貫通ドメインと細胞質信号ドメインの信号を転送する細胞内シグナル伝達蛋白質との相互作用を持つタンパク質を膜に埋め込まれて5,4,76,べん毛モーター。
11 の異なる化学受容器はcゲノム4,8で識別されています。これらの化学受容器の一部だけが特徴づけられているまでと Tlp1113 Tlp712Tlp411Tlp310,11Tlp19のリガンド特異性が知られています。この種の残りの化学受容器と他の細菌の多数の化学受容器の天然リガンドの同定が折り畳まれた、非常に純粋な組換え受容体リガンド14,の生産によって大幅に促進すること15,16しますただし、クローンエシェリヒア属大腸菌細菌化学受容器のペリプラズム リガンドをよく表現しようと封入体17,18,19 に彼らをターゲットに発生。.それにもかかわらず、この現象ことができます簡単に分離とリカバリを実現タンパク質の手に。ここでは、封入体からのタンパク質の回収、リフォールディングと例としてc受容体 Tlp3 のペリプラズム LBD を使用して浄化手法を提案します。この例は、Tlp3 LBD dCACHE 家族20の 2 成分ヒスチジンのキナーゼおよび原核生物20,21,の化学受容器に豊富ある検出ドメインに属するために選ばれました。22,23。
このアプローチで pET151/D ・ TOPO ベクトルに基づいた表現の構成要素は、彼の6N ターミナルを組み込む設計されています-タグの直後にタバコによってエッチング ウイルス (TEV) プロテアーゼ胸の谷間サイト、その後タグ除去19。プロトコルでは、封入体のタンパク質リフォールディング尿素減少によって尿素による脱色、分離大腸菌タンパク質発現について説明します。次のリフォールディング、サンプルは、オプションのタグ除去とサイズ排除クロマトグラフィーとのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって浄化されます。浄化された蛋白質の折られた状態を確認するには、円偏光二色性分光法を用いた.これは、以前異種受容体、ピロリ菌TlpC19の LBD を浄化し、回復に培われたメソッドの修正版です。この手順は、図 1の要約の蛋白質の純度と純粋なタグなし Tlp3 LBD 細菌文化、1 L あたりの 10-20 mg を得られます > SDS-PAGE により見積もられた 90%。
表現と細菌の化学受容器 Tlp3 のペリプラズム LBD の封入体から巻き戻しのための簡単な手順が表示されます。純粋な蛋白質の準備エシェリヒア属大腸菌、浄化および封入体の脱色でペット プラスミド エンコード遺伝子の過剰発現は、連続の親和性によって精製し変性タンパク質のリフォールディングとサイズ排除クロマトグラフィーの手順を実行します。容易に尿素変性とリフォール…
The authors have nothing to disclose.
ゆう c. リューにありがとう Tlp3 LBD 生産の彼の初期の作品。Mayra A. マチューカ Departamento Admistrativo de サイエンス、テクノロジー e Innovación COLCIENCIAS 博士奨学金に恩義ている。
Tris base | AMRESCO | 497 | |
Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |