간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로
Summary
우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.
Introduction
감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서1 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. , 2. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.
분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스 성 입자를 복제3의 단일 라운드 후 표현 되는 하위 게놈 녹색 형광 단백질 (GFP) replicon 인코딩. 이와 같이, RVPs에 감염 되는 세포 형광 녹색 및 cytometry 또는 현미경을 사용 하 여 쉽게 감지가 가능. 이 분석 결과에서 사용 하는 RVPs 상용 소스 로부터 얻은 했다. 그러나 그들은,, 수 다른 바이러스에 대 한 생성 하 고이 원고에서 설명 하는 분석에 사용. 한편, K562 세포는 FcγIII 수용 체 표현 하는 백혈병 세포 선 항 체의 Fc 지역에 바인딩할 하 고 하위 중화 항 체4,5의 농도 존재 감염 될 있습니다.
에이드 분석 심한 뎅기열 및 생체 외에서 ADE의 메커니즘을 나타내는 위험 요인 조사 연구에서 광범위 하 게 사용 된6,,78. 여기에 설명 된 에이드 분석 결과 신속 하 고 쉽게 사용할 수 RVPs를 사용 하 여 체 외에서 감염을 강화 하 고 flow cytometry, 현재 사용 중 하나 필요로 하는 다른 분석에 비해 플 라크 형성의 결정에 대 한 혈 청의 용량을 확인 Vero 세포 또는 항 체의 얼룩에 (pfu) 단위 세포6,7,,89,10,11, 둘 다 시간이 소요 되며 노동 감염 집중.
Protocol
Representative Results
Discussion
DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses1,2. 교차 감염?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
설명된 프로젝트 JJM에 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학에서 기금에 의해 지원 되었다. 의견이 나 주장을 여기에 포함 된 저자의 개인 그들 고 수 해석으로 공식 또는 반영의 플레이 국방부, 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학 또는 미국의 다른 기관 정부입니다.
WGV 모든 실험을 수행 하 고 분석 데이터; JJM 설계 하 고 감독 연구; WGW와 JJM 종이 썼다.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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