Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

Summary

Cet article décrit une méthode de microarray de protéine simple pour profilage immunité humorale à un panel de 7-plex de hautement purifié des antigènes de Clostridium difficile dans les sérums humains. Le protocole peut être prolongé pour la détermination de la production d’anticorps spécifiques dans les préparations d’immunoglobulines par voie intraveineuse polyclonal.

Abstract

Nous fournissons un aperçu détaillé d’un essai de microarray de nouvelle protéine de haut-débit pour la détermination de l’anti –Clostridium difficile taux d’anticorps dans le sérum humain et dans les préparations distinctes de polyclonal immunoglobulines intraveineuses (IgIV). Le protocole décrit les étapes méthodologiques impliqués dans la préparation de l’échantillon, impression de tableaux, mode opératoire et l’analyse des données. En outre, ce protocole pourrait être développé pour intégrer divers échantillons cliniques, y compris le plasma et les surnageants de culture de cellules. Nous montrons comment microarray de protéine peut être utilisée pour déterminer une combinaison d’isotype (IgG, IgA, IgM), de la sous-classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) et anticorps spécifiques à la souche hautement purifiée de toute c. difficile les toxines A et B (toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087), la toxine B d’une souche exprime c. difficile toxine-B-only (CCUG 20309), une forme de précurseur d’un fragment de B de la toxine binaire, pCDTb, des protéines spécifiques ribotype couche toute la surface (SLPs ; 001, 002, 027) et le contrôle des protéines (tétanos anatoxine tétanique et Candida albicans). Pendant l’expérience, microarrays sont détectés avec des sérums de personnes atteintes d’infection à c. difficile (CDI), personnes atteintes de fibrose kystique (FK) sans diarrhée, témoins sains (HC) et de personnes préalables et post-IVIg thérapie pour la traitement de la CDI, l’immunodéficience combinée trouble et polyradiculopathy démyélinisante inflammatoire chronique. Nous rencontrons en efficacité de neutralisation de la toxine et taux d’anticorps spécifiques multi-isotype des différences significatives entre les groupes de patients, les préparations commerciales d’IgIV et sérums avant et après administration d’IgIV. En outre, il y une corrélation significative entre microarray et immuno enzymatique (ELISA) pour les IgG d’antitoxine dans le sérum. Ces résultats suggèrent que « microarray » pourrait devenir un outil prometteur pour le profilage d’anticorps aux antigènes de C.difficile chez les humains vaccinés ou infectés. Avec plus de raffinement des panneaux de l’antigène et une réduction des coûts de production, nous prévoyons que microréseau technologie peut aider à optimiser et sélectionnez les immunothérapies plus cliniquement utiles pour l’infection à c. difficile d’une manière spécifique au patient.

Introduction

Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de microarray de protéine originale et personnalisée pour la détection et la quantification semi de souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Nous utilisons avec succès notre c.difficile-dosage spécifique « microarray » comme un nouvel outil prometteur pour la bioanalyse composition du contenu spécifique d’anticorps dans le sérum du patient^1,2, préparations d’IgIV³, et identification des spécificités anticorps qui sont en corrélation avec les mauvais résultats en CDI⁴. Nous démontrons comment fin des échantillons de sérum et de préparations commerciales d’IgIV peuvent être analysées sur lames microarray, permettant qualité reproductible profilage des réponses anticorps pathogène spécifique c. difficile dans cet essai.

Beaucoup de santé des enfants et d’adultes ont des anticorps IgG et IgA sériques détectables toxines de c. difficile A et B^5,6. Ceux-ci sont censés survenir suite à l’exposition transitoire au cours de la petite enfance et après une exposition à c. difficile à l’âge adulte. Pour cette raison, polyclonal IgIV a été utilisé hors AMM pour traiter les récurrentes et fulminante CDI^7,8,9. Cependant, son rôle définitif et son mode d’action reste peu clair. Plusieurs études ont montré que la réponse immunitaire humorale aux toxines de Clostridium joue un rôle dans la présentation de la maladie et les résultats. Plus particulièrement, les patients asymptomatiques montrent une concentration accrue de sérum anti-toxine A IgG comparée aux patients qui développent une maladie symptomatique¹⁰. Une association démontrable a été rapportée pour médian anti-toxines IgG A des titres et¹¹de la mortalité de toutes causes de 30 jours. Plusieurs rapports ont également révélé une liaison avec une protection contre les réponses anticorps et la récurrence à la toxine A, B et plusieurs antigènes non-toxine (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD et protéines de la couche superficielle (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. ces observations ont stimulé le développement de la première Immunothérapie passive drogue ciblage c. la toxine B (bezlotuxumab), qui a récemment été approuvé par la US Food and Drug Administration et l’européenne des médicaments Agence pour la prévention des renouvelables CDI¹⁶. Stratégies de vaccination à l’aide de toxines inactivées ou fragments de toxine recombinantes sont également en cours de développement^17,18,19. Ces nouvelles approches thérapeutiques stimulera sans doute l’exigence d’évaluation immunité humorale aux antigènes multiples dans vastes échantillons.

Aujourd’hui, il y a un manque notable d’essais disponibles dans le commerce de haut débit capable de mesurer simultanément la souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Il y a un besoin de développer ces tests afin de faciliter les efforts de recherche futurs et des applications cliniques. Microarrays de protéine sont une méthode d’immobiliser un grand nombre de protéines purifiées individuellement sous forme de tableau dans l’espace organisé des taches sur une surface microscopique axée sur la diapositive à l’aide d’un système robotisé qui peut être un contact²⁰ ou un sans contact outil d’impression²¹. Les taches peuvent représenter des mélanges complexes tels que les lysats cellulaires, anticorps, homogénats tissulaires, protéines endogènes ou recombinantes ou peptides, fluides corporels ou médicaments^22,23.

Technologie des microréseaux protéine offre des avantages distincts par ELISA interne standard techniques, qui ont traditionnellement été utilisées pour évaluer les réponses en anticorps anti –c. difficile . Il s’agit d’une capacité accrue pour détecter toute une série d’anticorps multi isotype-spécifiques contre un panel plus large de cibles protéiques, exigences de diminution du volume pour les antigènes, les échantillons et les réactifs et une capacité accrue d’intégrer un plus grand nombre de réplicats techniques, en plus du contrôle de qualité interne multiple (QC) mesure¹. Puces sont donc plus sensible, précise et reproductible et ont une plus grande gamme dynamique. Ces facteurs rendent les microarrays une alternative meilleur marchée et potentiellement favorable à ELISA pour la détection à grande échelle des protéines connues. Cependant, inconvénients de la technologie des microréseaux résultent principalement des grandes coûts initiaux associés instituant un groupe d’antigènes hautement purifiés et mise en place de la plate-forme technologique.

Microarrays de protéine ont été largement utilisées pendant les deux dernières décennies comme un outil de recherche diagnostique et fondamentales en applications cliniques. Les applications spécifiques comprennent l’expression de la protéine de profilage, l’étude des relations d’enzyme / substrate, dépistage de biomarqueurs, analyse des interactions hôtes-microorganismes et profilage des anticorps spécificité^{23,24, 25,26,27,28}. Nombreux nouveaux pathogènes/antigène de protéine microarrays ont été établis, y compris le paludisme (Plasmodium)²⁹, VIH-1,³⁰,³¹de la grippe, syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)³², fièvre hémorragique virale³³ , virus de l’herpès³⁴et³⁵de la tuberculose.

Le présent protocole est liée à la mise en place d’un simple fonctionnement C. réactive antigène microarray test difficile , qui permet une quantification exacte, précise et spécifique des multi-isotype et production d’anticorps spécifiques à la souche à C. difficile antigènes dans le sérum et polyclonaux IgIV. Dans les présentes, nous incluons des résultats représentatifs se rapportant à une performance de dosage microarray acceptable par rapport à ELISA ainsi que le dosage de précision et reproductibilité de profils. Ce test pourrait être développé pour définir le profil des autres échantillons cliniques et établit un nouveau standard pour la recherche dans les bases moléculaires de l’IDC.

Protocol

1. préparer une plaque de Microarray Diluer les antigènes de c. difficile avec un tampon d’impression [PBS-Tween-tréhalose (50 mM)] à la concentration optimale (qui a été prédéfinie avant d’exécuter le sérum du patient) : toxines A (200 µg/mL) et B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) et natif de purifiée SLPs ensemble dérivé ribotypes 001, 002 et 027 (200 µg/mL).Remarque : La toxine B proviennent d’une toxine B exprimant la souche CCUG 20309 (90 µg/mL). Diluer les contr…

Representative Results

La figure 1 illustre un organigramme décrivant les principales étapes dans le protocole décrit. La figure 2 montre des essais de corrélation de Spearman démontrant l’important accord entre microarray et ELISA IgG et IgA anti-toxine A et B niveaux dans le sérum de patients test. La figure 3 montre classe-anticorps IgG et IgA différentielle d’anticorps spécifiques à la toxine A et la toxin…

Discussion

Dans ce protocole, nous avons montré que « microarray » est une plate-forme appropriée pour définir l’immunité humorale aux antigènes de protéines de c. difficile dans le sérum du patient (Figures 3 et 6) et les préparations commerciales d’IgIV (Figure 5). Nous avons aussi démontré que la technique de microarray effectue bien par rapport aux classique ELISA (Figure 2) et montre excellente reproductibil…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A