Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

Summary

Este artículo describe un método de microarrays de la proteína simple para perfiles de respuesta inmune humoral a un panel de 7-plex de altamente purificaron antígenos de Clostridium difficile en suero humano. El protocolo puede ampliarse para la determinación de las respuestas de anticuerpos específicos en los preparados de inmunoglobulina intravenosa policlonal.

Abstract

Le ofrecemos una descripción detallada de un análisis de microarray de la novela de alto rendimiento de proteína para la determinación de anti –Clostridium difficile los niveles de anticuerpos en suero humano y en preparaciones separadas de inmunoglobulina policlonal intravenosa (IgIV). El protocolo describe los pasos metodológicos involucrados en la preparación de muestras, impresión de matrices, procedimiento de ensayo y análisis de datos. Además, este protocolo podría ser desarrollado para incorporar diversas muestras clínicas incluyendo plasma y sobrenadantes de cultivo de células. Mostramos cómo microarrays de la proteína se pueden utilizar para determinar una combinación de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), y anticuerpos específicos de cepa altamente purificaron toda C. difficile toxinas A y B (toxinotype 0, tensión VPI 10463, ribotipo 087), la toxina B de una C. difficile toxina B-sólo expresando su cepa (CCUG 20309), una forma precursora de un fragmento de B de la toxina binaria, pCDTb, proteínas específicas ribotype de toda la superficie de la capa (PHL, 001, 002, 027) y control de las proteínas (tétanos tetánico y Candida albicans). Durante el experimento, microarrays están sondeados con sueros de individuos con infección por C. difficile (CDI), las personas con fibrosis quística (FQ) sin diarrea, controles sanos (HC) y de individuos pre- y post-IgIV tratamiento para la tratamiento de la CDI, el trastorno de inmunodeficiencia combinada y Polirradiculopatía desmielinizante inflamatoria crónica. Encontramos diferencias significativas en eficacia de neutralización de la toxina y los niveles de anticuerpos específicos de isotipo multi entre los grupos de pacientes, preparados comerciales de IVIg y sera antes y después administración de IVIg. También, hay una correlación significativa entre el microarray y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) para los niveles de antitoxina IgG en muestras de suero. Estos resultados sugieren eso microarray podría convertirse en una herramienta prometedora para perfilar las respuestas del anticuerpo a los antígenos de C.difficile en seres humanos infectados o vacunados. Con el mayor refinamiento de los paneles de antígeno y una reducción en los costos de producción, esperamos que la tecnología de microarrays puede ayudar a optimizar y seleccionar las inmunoterapias más clínicamente útiles para la infección de C. difficile en un modo específico para cada paciente.

Introduction

Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo de microarray de proteínas novedosas y personalizadas para la detección y semi-cuantificación de cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Utilizamos con éxito nuestro C. difficile-análisis de microarrays específicas como una nueva herramienta prometedora para el Bioanálisis composición de contenido de anticuerpos específicos en el suero del paciente^1,2, preparaciones de IVIg³, y identificación de especificidades de anticuerpos que se correlacionan con resultados deficientes en el CDI⁴. Demostramos cómo biobanked sueros y preparados comerciales de IVIg pueden ser analizadas en microarray diapositivas, permitiendo alta calidad reproducible de perfiles de las respuestas de anticuerpos patógenos específicos de C. difficile en este ensayo.

Muchos niños y adultos sanos tienen anticuerpos IgG e IgA sérica detectable las toxinas de C. difficile A y B^5,6. Éstos se piensan para presentarse después de la exposición transitoria durante la infancia y después de la exposición a C. difficile en la edad adulta. Por esta razón, inmunoglobulina policlonal intravenosa ha sido utilizado apagado-etiquete para tratar recurrentes y fulminante CDI^7,8,9. Sin embargo, su papel definitivo y modo de acción está claro. Varios estudios han demostrado que la respuesta inmunitaria humoral a las toxinas de C. difficile desempeña un papel en la presentación de la enfermedad y el resultado. En concreto, pacientes asintomáticos muestran una mayor concentración del suero antitoxina A IgG en comparación con los pacientes que desarrollan enfermedad sintomática¹⁰. Una asociación demostrable se ha divulgado para mediana antitoxina IgG A títulos y todas las causas mortalidad a 30 días¹¹. Varios informes también han revelado una asociación con una protección contra respuestas recurrencia y anticuerpos a la toxina A, B y varios antígenos no toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD y proteínas de la capa superficial (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. estas observaciones han estimulado el desarrollo de la primera inmunoterapia pasiva de drogas dirigida a C. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recientemente ha sido aprobado por el alimento y administración de drogas y los medicamentos europeos Agencia para la prevención de la recurrente de la CDI¹⁶. Estrategias de vacunación con toxinas inactivadas o fragmentos de toxina recombinante también están actualmente bajo desarrollo^17,18,19. Estos nuevos enfoques terapéuticos sin duda estimulará el requisito para la evaluación de la respuesta inmune humoral a múltiples antígenos en tamaños de muestra grandes.

Hoy en día, hay una notable falta de ensayos de alto rendimiento disponibles en el mercado capaz de evaluar simultáneamente la cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Hay una necesidad para el desarrollo de estos ensayos para facilitar esfuerzos de futuras investigaciones y aplicaciones clínicas. Microarrays de la proteína son un método para inmovilizar grandes cantidades de proteínas purificadas individualmente como una matriz espacial organizada de puntos sobre una superficie microscópica basada en diapositivas utilizando un sistema robótico, que puede ser un²⁰ de contacto o sin contacto herramienta²¹de la impresión. Los puntos pueden representar mezclas complejas como los lysates de la célula, los anticuerpos, homogenados de tejido, proteínas endógenas o recombinantes o péptidos, fluidos corporales o drogas^22,23.

Tecnología de microarrays de proteínas ofrece distintas ventajas sobre ELISA interna estándar técnicas, que tradicionalmente se han utilizado para evaluar las respuestas de anticuerpos de anti –C. difficile . Estos incluyen un aumento de la capacidad para detectar una gama de los multi-isotipo-específicos anticuerpos contra un panel más amplio de objetivos de la proteína, volumen reducido requisitos para antígenos, las muestras y reactivos y una mayor capacidad para incorporar una mayor número de repeticiones técnicas, además de múltiples control interno de calidad (QC) mide¹. Microarrays son por lo tanto más sensibles, precisos y reproducibles y tener un mayor rango dinámico. Estos factores hacen microarrays una alternativa más barata y potencialmente favorable a ELISA para la detección a gran escala de las proteínas conocidas. Sin embargo, desventajas de la tecnología de microarrays resultan principalmente de los grandes costos iniciales asociados con establecer un panel de antígenos altamente purificados y configuración de la plataforma tecnológica.

Microarrays de la proteína se han utilizado en las últimas dos décadas como una herramienta de diagnóstico investigación básica en aplicaciones clínicas. Aplicaciones específicas incluyen la expresión de la proteína de perfiles, el estudio de las relaciones enzima-sustrato, investigación de biomarcadores, análisis de las interacciones huésped-microbio y perfiles de anticuerpos de especificidad de^{23,24, 2526,}de^,27,28. Se han establecido muchos nuevos microarrays de proteínas antígeno patógeno, incluyendo la malaria (Plasmodium)²⁹,³⁰de VIH-1, influenza³¹, síndrome respiratorio agudo severo (SARS)³², fiebre hemorrágica viral³³ , herpesviruses³⁴y³⁵de la tuberculosis.

El presente Protocolo se relaciona con el establecimiento de un fácil funcionamiento C. difficile reactivo antígeno microarray ensayo, que permite la cuantificación exacta, precisa y específica de multi-isotipo y las respuestas de anticuerpos específicos de cepa a C. difficile antígenos en suero e inmunoglobulina intravenosa policlonal. En este documento, se incluyen resultados representativos pertenecientes a un funcionamiento de ensayo de microarray aceptable comparado con ELISA, así como análisis de precisión y reproducibilidad perfiles. Este análisis podrían desarrollarse aún más para otras muestras clínicas de perfil y establece un nuevo estándar para la investigación en bases moleculares de la CDI.

Protocol

1. preparar una placa de microchips Diluir los antígenos de C. difficile con un tampón de impresión [PBS-Tween-trehalosa (50 mM)] a la concentración óptima (que estaba predefinida antes de ejecutar el suero del paciente): toxina (200 μg/mL) y la toxina B (100 μg/mL), pCDTb (200 μg/mL) y natural purificada SLP todo deriva de Benito 001, 002 y 027 (200 μg/mL).Nota: La toxina B se obtuvo de una toxina B-expresión cepa CCUG 20309 (90 μg/mL). Diluir los controles positivos, lisados de…

Representative Results

La figura 1 muestra un diagrama de flujo que describe los principales pasos en el protocolo descrito. La figura 2 muestra pruebas de correlación de Spearman demostrar acuerdo entre microarray y ELISA para IgG e IgA los niveles A y B en los sueros de pacientes de prueba. La figura 3 muestra diferencial IgG e IgA anticuerpos clase las respuestas de anticuerpos específicos a la toxina A y toxina B tox…

Discussion

En este protocolo, hemos demostrado que eso microarray es una plataforma adecuada para la definición de respuesta inmune humoral a antígenos de la proteína de C. difficile en el suero del paciente (figuras 3 y 6) y preparados comerciales de IgIV (figura 5). También hemos demostrado que la técnica de microarray realiza bien en comparación con ELISA convencional (figura 2) y muestra excelente reproducibilidad, intra…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A