Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración
Summary
Aquí se describe un protocolo para el establecimiento y cultivo derivado de humano y ratón 3 dimensiones (3D) gástrico organoides y el método para la transferencia de organoides 3D a una monocapa de 2 dimensiones. También se describe el uso de la monocapa epitelial gástrica como un análisis nuevo de cero-herida para estudios de regeneración.
Abstract
Estudios in vitro de reparación de herida gástrica implica típicamente el uso de líneas celulares de cáncer gástrico en un ensayo de scratch-herida de proliferación celular y migración. Una limitación crítica de tales ensayos, sin embargo, es su surtido homogéneo de tipos celulares. La reparación es un proceso complejo que exige la interacción de varios tipos celulares. Por lo tanto estudiar una cultura desprovista de subtipos celulares, es una preocupación que debe superarse si queremos entender el proceso de reparación. El modelo de organoide gástrico puede aliviar este problema por el que la colección heterogénea de tipos de la célula refleja cerca del epitelio gástrico u otros tejidos nativos en vivo. Demostrado aquí es una novela en vitro arañazo herida ensayo derivado de humanos o ratón organitas 3-dimensional que luego pueden ser transferidos a una monocapa epitelial gástrica sea organitas intacta o como una suspensión unicelular de disociaron organoides. El objetivo del protocolo es establecer organoides derivados gástricas epiteliales monocapas que pueden utilizarse en un sistema de análisis de nuevo heridas de rasguño para el estudio de regeneración gástrica.
Introduction
El uso de scratch-herida ensayos es un método popular para el estudio de regeneración y reparación1,2,3,4,5,6. La metodología propuesta puede ser utilizada para estudiar específicamente gástrica regeneración y colonización de Helicobacter pylori . En el pasado, líneas celulares de cáncer gástrico se han utilizado como un medio para el estudio de la infección de Helicobacter pylori (H. pylori)1,2 y hasta cáncer gástrico recientemente líneas celulares como las células AGS eran favorecidos1 ,2,3,4. Una limitación de las culturas de célula de cáncer gástrico es su fracaso para recapitular la diversidad celular del epitelio gástrico. Para intentar abordar esta limitación, demostrado que aquí es la creación y transferencia de primario derivado del humano y del ratón 3-dimensional fúndica gástrica organoides (FGOs) a una monocapa epitelial gástrica para los ensayos de curación herida basado en un método modificado de primero descrito por Schlaermann et al. 7 demostrar que monocapas epiteliales gástricas derivadas de esquilan 3D FGOs gástricos o FGO-derivó las células mantienen una composición celular polarizada que representa cerca del epitelio gástrico en vivo. Dado que las líneas celulares de cáncer gástrico no demostró la composición de la célula que muestra esta técnica, el protocolo actual tiene la ventaja sobre métodos alternativos de scratch-herida. Esta metodología ha sido optimizada por el monocapas pueden ser establecido de organoides todo o de una suspensión unicelular de organoides disociado y plateado usando una matriz de la membrana basal o capa de colágeno. El objetivo general del presente Protocolo es establecer que un organoide derivados cultivos monocapa epitelial gástrico para un ensayo de novela herida curativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
El actual protocolo de detalles de la creación de derivados de humanos y de ratón gástricas epiteliales monocapas que se puede utilizar para los ensayos de cero-herida. El protocolo depende el concepto de células madre residentes tejidos de aislamiento de humanos primarios (o ratón) y es un protocolo modificado publicado por primera vez por Schlaermann et al7. En particular, hemos optimizado el protocolo aquí para establecer un confluente y polarizado monocapa epitelial gástrica qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el NIH (NIDDK) 5 DK083402-07 R01 grant (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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