Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu
Summary
Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EVs) membranöz veziküller hücreler çeşitli hücre dışı microenvironment içine tarafından yayımlanan vardır. EVs heterojen veziküller, nüfusu 40 ve 1000 nm arasında bağlantı boyutu aralığı temsil eder. Birikmiş kanıt EVs patojen-host etkileşimlerde önemli düzenleyici rol oynarlar belirtti. Paraziti EVs derin bir anlayış anlayışlar paraziti-ana etkileşimler, şistozomiyazis karşı yeni strateji geliştirme sağlayan temel mekanizmaları sağlamalıdır. Burada, daha fazla yetişkin Schistosoma japonicum (S. japonicum) yalıtım ve EVs karakterizasyonu için bir protokol sunarak schistosomes işlevlerinde EVs çalışma hedefliyoruz. EVs vitro kültür bir ticari eksozom izolasyon kiti ile kombine Santrifüjü kullanarak ortamdan izole edildi. İzole S. japonicum EVs (SjEVs) genellikle 100-400 nm çapında sahip ve iletim elektronik mikroskobu ve western Blot ile karakterizedir. SjEVs boya etiketli PKH67 kullanımını SjEVs alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Genel olarak, bizim iletişim kuralı EVs yetişkin schistosomes izole için alternatif bir yöntem sağlar; izole SjEVs fonksiyonel analiz için uygun olabilir.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EVs) küçük membran bağlı veziküller çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitler ile kapsüllü bir nüfusu vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs hücre-hücre iletişim çok önemli bir rol oynamaktadır ve hücre gelişimini, bağışıklık düzenlemesi, anjiogenez ve hücre geçiş2de dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik süreçlerin yönetmelikte yer gösterdi, 3,4,5. Delil biriktiriyor EVs, exosomes ve onların miRNA kargo dolaşan bazı hastalıklar6potansiyel biyolojik temsil ettiğini gösterir.
Trikomonas vajinalis, Trypanosoma cruzive LEISHMANIA sppgibi birkaç protozoa., EVs; salgılar edebilmek için gösterilen archlar Ayrıca bulundu EVs yaşam içine salgılaması için7ev sahipliği yaptı. Paraziter EVs enfeksiyon, patojen8ve bağışıklık Yönetmeliği9bakım dahil olduğu gösterilmiştir. Son schistosomes içinde her iki Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 çalışmalar ve S. japonicum12 yetişkin schistosomes olabilir eksozom benzeri veziküller salgılar belirtilmiştir var Belirli biyolojik süreçlerin fonksiyonel Yönetmeliğinde yer.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler ultrasantrifüj, Ultrafiltrasyon13, polimer esaslı reaktifler, boyut-dışlama Kromatografi ve immunoaffinity yalıtım kullanımı gibi hücre dışı veziküller izole etmek için kullanılmıştır. Bu farklı yöntemler kendi avantajları ve sınırlamalar14bulunur. Genel olarak, ultrasantrifüj vezikül yalıtım için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Ancak, bu yöntem potansiyel EV toplama14sınırlama uğrar.
Schistosomes, yöntemleri bir çift EV yalıtımı için bildirilmiştir: Bu ultrasantrifüj11,12,10 ve çeşitli aşamalarında (yumurta16, ticari EV yalıtım Seti16 kullanımını içerir schistosomula11, Yetişkin schistosomes10,12,17). Microvesicles birkaç yüz nanometre boyutundan bin nanometre için geniş bir göz önüne alındığında olduğuna göre biz tezgah santrifüj, Ultrafiltrasyon ve üzerinden EVs yalıtmak için ticari bir EV izolasyon kit kullanımı ile birleştiren alternatif bir yöntem geliştirdi Yetişkin Schistosoma japonicum. İzole EVs genellikle 100-400 nm çapında sahip ve başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş.
Protocol
Representative Results
Discussion
EVs üzerinde son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs ana bilgisayar-patojen etkileşimleri3,9,12,16‘ önemli bir rol oynamaktadır bu paraziti gösterdi. Daha fazla adrese düzenleyici işlevleri, EVs schistosomes yalıtmak için gerekli olduğunu. Burada, SjEV yalıtım için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem SjEVs, geniş Aralık boyutunu 100 verimleri nm 400 nm, Yeti?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada, kısmen ya da bütün olarak, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31472187 ve 31672550) ve tarım bilim ve teknoloji yenilik programı Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından desteklenen.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
