Desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con RNA en células de mesotelioma

Summary

Desthiobiotin etiquetado de un sintético 25-nucleótido RNA oligo, que contiene un motivo de elementos ricos en adenina (ARE), permite la unión específica de proteína citosólica son.

Abstract

El en vitro RNA-telecine se utiliza todavía en gran parte en los primeros pasos de protocolos dirigidos a identificar proteínas de unión de ARN que reconocen determinados motivos y estructuras de ARN. En este protocolo de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA están marcadas con una forma modificada de la biotina, desthiobiotin, en el 3′ terminal del filamento del RNA, que se une reversiblemente a estreptavidina y permite así la elución de proteínas bajo más fisiológica condiciones. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. El método aquí descrito puede aplicarse para detectar la interacción entre proteínas RNA conocidas y una sonda de RNA largo (nt) de 25 nucleótidos que contiene una secuencia de interés. Esto es útil para completar la caracterización funcional de estabilizar o desestabilizar elementos presentes en las moléculas de ARN alcanzadas usando un análisis de vectores de reportero.

Introduction

Expresión génica y el nivel final del producto del gene pueden ser reguladas fuertemente afectando la estabilidad del ARNm y ARNm traducción tarifa¹. Estos mecanismos de regulación postranscripcional se ejercen a través de las interacciones de no codificante del RNA y RNA-que ata las proteínas (restrictivas) con el mRNA específicos. Generalmente es el 3′ región sin traducir de mRNA (3′ UTR – pertenecientes a la parte no codificante del genoma²) que contiene específico cis-elementos reguladores (CRE), que son reconocidos por trans-actúan factores como miRNA o restrictivas ³. el mejor estudio cis-elemento dentro de los 3′ UTR, es el adorno de elementos ricos en adenina (son), que es reconocido por proteínas específicas AU (AUBP) y, a su vez, induce o mRNA degradación/deadenylation (mediada son decaimiento) o mRNA estabilización⁴.

El tamaño de los 3′ UTR del calretinin mRNA (CALB2) es 573 bp largo y contiene una supuesta AUUUA pentámero, como AREsite2, una herramienta bioinformática del⁵. Consistente con la presencia de un supuesto motivo son, el análisis de vector-reportero de pmirGLO había demostrado un papel de estabilización de este elemento dentro de mRNA CALB2⁶. Por último, el en vitro RNA-telecine se utilizó para identificar la AUBP que estabiliza calretinin mRNA mediante el adorno son.

Pues todo no-codificación RNAs interactúan con proteínas⁷, el en vitro RNA-telecine es una buena forma y análisis de primera de elección para la identificación de RNA-interactianos a ayudar a descifrar los mecanismos moleculares. En este método de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA, que fueron etiquetadas con una forma modificada de la biotina (desthiobiotin) en la terminal 3′ de la hebra de RNA, fueron utilizadas. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el limite-RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. Tales proteínas RNA-bound se eluyen de las bolas magnéticas, a través de un gel de SDS-PAGE de 12%, transferidos a una membrana y sondeado con los diferentes anticuerpos.

En el procedimiento de purificación de afinidad estándar de estreptavidina-biotina, desnaturalización dura condiciones se requieren interrumpir el vínculo fuerte biotina-estreptavidina irreversible para eluir las proteínas límite⁸, que podría conducir a la disociación de complejos de la proteína. A diferencia de la biotina, desthiobiotin se une a estreptavidina reversible y se desplaza competitivamente con una solución de biotina, lo que permite la elución suave de proteínas y evitar el aislamiento de naturalmente biotinilado moléculas⁹ lo que sugiere que la técnica es ideal para el aislamiento de complejos de proteína nativa en condiciones nativas.

In vitro condiciones obligatorias y rigor, que están determinadas por la concentración de sales, agentes reductores y porcentaje de detergente, deben estar cerca de los presentes en el contexto celular con el fin de identificar interacciones de verdad en vivo . Las condiciones vinculantes en este documento han sido previamente demostradas según corresponda para la identificación de lo HuR como una AU-que atan la proteína¹⁰. Este enfoque podría ahorrar tiempo, ya que la optimización de las condiciones de enlace adecuada puede ser difícil y desperdiciador de tiempo. Además, este método podría utilizarse como un protocolo inicial para cualquier experimento de RNA-desplegable y puede optimizarse gradualmente cambiando la concentración de sales y detergentes, cambiando el porcentaje de glicerol y adición de otras sales. Por otra parte, hemos demostrado que incluso una corto 25-nucleótido RNA sonda albergando un pentámero son motivo podía utilizarse para demostrar la interacción con una AUBP específico.

Protocol

1. preparación de la fracción de proteínas citosólicas y nucleares Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células en un frasco de cultivo celular T150 cultivadas en RPMI – 1640 medio suplementado con 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5.5 x 106 células), proceder a la extracción de proteínas de la fracción nuclear y citosólica.Nota: Línea de celular de ACC-MESO-4 se obtuvo de la RIKEN BioR…

Representative Results

En este experimento, un fragmento largo 25-nt de calretinin 3′ UTR que es motivo (CALB2 3′ UTR (son) 25-nt) fue utilizado para probar si se une específicamente a la proteína del antígeno humano R (HuR), un conocido estabilizador de mRNA. Para probar la especificidad del elemento son, un RNA 25 nt sonda CALB2 3′ UTR (mtARE) que contiene una mutación son Adorno, que previamente fue demostrada para suprimir el efecto de estabilización del motivo son, fue usado6. …

Discussion

3′ UTRs pertenecen al genoma no codificante³, y todos los RNAs no codificantes pueden interactuar con proteínas para ejercer su función⁷. Cuando el genoma mamífero fue encontrado para ser transcrito lo impregna y produjeron una porción significativa de larga noncoding RNAs¹⁶, nuevas evidencias demostraron que estos larga noncoding RNAs función en la regulación de expresión génica al interactuar con remodelación de cromatina complejos<sup cla…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637