Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion
Summary
Brandpilze verursachen viele verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie sind als schlafenden Brandsporen zerstreut, die als Reaktion auf ökologische Hinweise zu keimen. Wir skizzieren zwei Methoden zur Untersuchung von molekularer Veränderungen während der Keimung: Atmung Erhöhung um Stoffwechselaktivierung erkennen Messung und Bewertung von molekularen Ereignisse durch die Isolierung Brandsporen in verschiedenen morphologischen Stadien ändern.
Abstract
Brandpilze sind die ätiologischen Agenten mehrere verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie zeichnen sich durch die Produktion von Brandsporen, die dickwandigen Zerstreuung Agenten sind. Brandsporen können jahrzehntelang inaktiv bleiben. Die Keimruhe zeichnet sich durch niedrige Stoffwechselrate, Makromolekulare Biosynthese angehalten und Ebenen der Atmung stark reduziert. Nach Erhalt der erforderlichen Umweltsignale, Keimen Brandsporen um haploide Zellen zu produzieren, die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen kann. Teliospore Keimung zeichnet sich durch die Wiederaufnahme der makromolekularen Biosynthese, erhöhte Atmung und dramatische morphologische Veränderungen. Um Veränderungen der Zellatmung in den frühen Stadien der Keimung genau zu messen, haben wir ein einfaches Protokoll mit einem Clark-Typ Respirometer entwickelt. Die späteren Stadien der Keimung zeichnen sich durch spezifische morphologische Veränderungen, aber Keimung ist asynchron. Wir entwickelten eine Mikrodissektion-Technik, die es ermöglicht uns Brandsporen auf unterschiedliche Keimung Stufen zu sammeln.
Introduction
Die Brandpilze (Ustilaginales) bestehen aus über 1.600 Arten, die Gräser, einschließlich der wichtigen Getreide Mais, Gerste und Weizen, verursacht Milliarden von Dollar in Ernteverluste zu infizieren jährlich1. Diese Pilze sind gekennzeichnet durch die Produktion von Brandsporen, die haben Zellwände dunkel pigmentiert und sind die Agenten der Zerstreuung. Brandsporen um genetische Material bei den Belastungen der Verbreitung zwischen Wirtspflanzen Schild funktionieren und können in einem schlafenden Zustand für Jahre2bestehen. Als solche sind Brandsporen ein wesentlicher Bestandteil der Ausbreitung der Krankheit.
Um Teliospore Biologie zu studieren, nutzt unser Labor Modell Smut Pilz Ustilago Maydis (U. Maydis), die der kausalen Agent der Krankheit “gemeinsame Smut von Mais” ist. Reifen U. Maydis Brandsporen zeichnen sich durch Wachstum Verhaftung, reduzierte Zellstoffwechsel und geringe Zellatmung3. Bei günstigen Umweltbedingungen (zB., das Vorhandensein von bestimmten Zuckern), U. Maydis Brandsporen Keimen und komplette Meiose, Herstellung von forstwirtschafter die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen können. Keimung zeichnet sich durch erhöhte Atmung, die Rückkehr zur metabolischen Aktivität und das Fortschreiten durch erkennbare morphologische Stadien der Keimung4.
Die erste Phase der Keimung umfasst erhöhte Atmung und Stoffwechsel-Funktion, es gibt jedoch keine morphologischen Hinweise auf Veränderungen. Das original der Atemwege Änderung U. Maydis vor über 50 Jahren Messungen wurden Sauerstoffverbrauch manometrically mit einem Warburg Kolben Apparat5messen. Wir haben eine neue, einfache Methode des Studiums präziser Änderungen in der Atmung während der Keimung der Teliospore durch die Messung von Sauerstoff-Verbrauch über einen zeitlichen Verlauf der Keimung mit einem Clark-Typ-Microrespirometer entwickelt. Wir zuvor verwendet diese Methode, Veränderungen der Atemfrequenz zwischen Wildtyp studieren U. Maydis haploiden Zellen und Mutanten mit defekte Mitochondrien6, und haben das Protokoll hier angepasst, um Veränderungen in der Teliospore Atmung während zu studieren Keimung. Dadurch können das Timing der Atmung Änderung genau zu identifizieren, so dass wir zum gegebenen Zeitpunkt nach der Einleitung der Keimung zu frühen molekularen Ereignisse untersuchen Brandsporen ausrichten können. Das Fortschreiten der Keimung kann mikroskopisch verfolgt werden, sobald der Promycelia ergibt sich aus der Teliospore, aber die asynchrone Natur, die Isolation der genug Brandsporen zu einem gegebenen Zeitpunkt für die Untersuchung gehemmt. Wir entwickelten eine Mikrodissektion Technik ähnlich denen für die in-vitro- Befruchtung, um körperlich Brandsporen an verschiedene morphologische Stadien der Keimung zu sammeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basidiomycete biotrophe Pflanzenpathogene verursachen jährlich Milliarden von Dollar in Ernteausfälle. Die überwiegende Mehrheit dieser Erreger produzieren Brandsporen, die integraler Bestandteil der Pilz Zerstreuung und geschlechtliche Fortpflanzung. Bei der Entwicklung und Keimung der Brandsporen zu gewinnen ist entscheidend für das Verständnis der Ausbreitung der verheerenden Krankheiten verursacht durch diese Pilze. Um molekulare Veränderungen an wichtigen Kontrollpunkten zu ermitteln haben wir eine Methode, um…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Dr. Paul Frost für den Gebrauch von seinem Microrespirometer und Nicole Wagner und Alex Bell für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde finanziert durch einen NSERC Grant, b.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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