细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。
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方法文章
基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞衰老是已知会负面影响健康寿命的衰老标志之一。能够在细胞培养中特异性清除衰老细胞的药物被称为衰老细胞裂解剂（senolytics），其可降低体内衰老细胞的负荷并延长健康寿命。迄今为止，已发现多种类型的衰老细胞裂解剂，包括HSP90抑制剂、Bcl-2家族抑制剂、胡椒碱（piperlongumine）、FOXO4抑制肽以及达沙替尼与槲皮素的联合用药（Dasatinib/Quercetin）。在溶酶体pH升高的条件下检测SA-β-Gal活性，是目前表征最充分的衰老细胞检测标志物之一。利用荧光底物C12FDG对衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性进行活细胞检测，并结合使用DNA嵌入染料Hoechst测定总细胞数量，使得研究人员能够筛选出具有抗衰老作用的药物：这类药物可通过清除衰老细胞从而降低整体SA-β-Gal活性（即衰老细胞裂解剂），或通过抑制SA-β-Gal及其他衰老细胞表型发挥作用（即衰老细胞表型调节剂，senomorphics）。采用高内涵荧光成像与分析平台，可实现对药物库在SA-β-Gal活性、细胞形态及细胞数量等方面效应的快速、高通量筛选。
引言
细胞衰老现象首次由 Leonard Hayflick 和 Paul Moorhead 描述，他们发现正常细胞在培养条件下增殖能力有限1。衰老细胞即使在营养物质、生长因子存在且无接触抑制的情况下也无法增殖，但仍保持代谢活性2。这一现象被称为复制性衰老，至少在人类细胞中主要归因于端粒缩短3。后续研究表明，细胞还可因其他刺激而进入衰老状态，例如癌基因应激（癌基因诱导的衰老，OIS）、DNA 损伤、细胞毒性药物或辐射（应激诱导的衰老，SIS）4,5,6。当发生DNA损伤（包括端粒损耗）时，若损伤无法修复，细胞可能进入衰老状态、启动不受控的细胞增殖，或发生凋亡。在此情况下，细胞衰老似乎具有益处，因其发挥肿瘤抑制作用2。相反，随着年龄增长，由于包括DNA损伤在内的细胞损伤不断累积，衰老细胞数量增加。由于衰老细胞能够分泌细胞因子、基质金属蛋白酶和生长因子，这种现象被称为衰老相关分泌表型（SASP），因此与年龄相关的细胞衰老及SASP的增加会导致组织稳态下降，进而促进衰老过程。此外，衰老负荷的年龄依赖性增加已被证实可诱导代谢性疾病、应激敏感性升高、早衰综合征以及愈合能力受损....
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方案
动物实验已获得斯克里普斯佛罗里达分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）衰老模型的制备——12-15天
- 分离野生型和 Ercc1-/- 如前所述，取自妊娠13天（E13）雌性小鼠的MEFs33.
注意：以下所有步骤均须在超净工作台中以无菌操作条件进行，并使用无菌器械。 - 在眼睛上方切除胚胎头部。
- 去除红色组织（心脏和肝脏），必要时用于基因分型。
- 配制 500 mL 含 10% 胎牛血清、1× 非必需氨基酸、青霉素和链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）与 Ham’s F10 培养基 1:1 混合液作为生长培养基，并将其预热至 37 °C 每次使用前约15分钟取出，恢复至室温。将培养基储存在 4 °C.
- 将剩余的胚胎用0.25%胰蛋白酶/EDTA孵育10分钟。
- 将胚胎切碎成1 mm大小的组织块，并用移液器反复吹打组织数次。
- 加入10 mL培养基，将每枚胚胎的组织接种至直径10 cm的细胞培养皿中（每皿接种一枚胚胎组织）（第0代）。
- 在培养箱中培养细胞 37 °C，3% O₂2，5% CO₂2.
注意：在此条件下，....
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结果
SA-β-半乳糖苷酶活性可在多种因素诱导下发生衰老的细胞中被检测到，这些因素包括复制性耗竭、基因毒性与氧化应激以及癌基因激活23,25,38。在当前使用Ercc1缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞的模型中，常氧培养条件（20% O2）在经过数次传代后足以诱导细胞衰老。野生型MEF细胞也会发生衰老，但在20% O2条件下需要更多的传代次数。图1展示了筛选实验的工作流程，从分离Ercc1缺陷型小鼠胚胎的原代MEF细胞开始，经氧化应激诱导细胞衰老，最终利用高内涵荧光显微镜分析所获得的显微图像数据。图2展示了MEF细胞培养的代表性图像，包括非衰老（年轻）细胞（图2
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讨论
SA-β-Gal 是一种明确的细胞衰老生物标志物，最初由 Dimri et al.（1995）发现，研究表明，在 pH 6 条件下检测时，衰老的人成纤维细胞的 SA-β-Gal 活性较增殖细胞显著升高23。此后，针对不同类型细胞和组织的体外及体内 SA-β-Gal 检测方法已被建立25,39,40。本方案中描述的基于荧光的单细胞活细胞检测 SA-β-Gal 的方法，是筛选影响细胞衰老药物的优良初筛工具17。然而，尽管 SA-β-Gal 被认为是检测衰老细胞最便捷的标志物之一，仍需结合其他细胞衰老标志物作为确证性检测，以评估药物的抗衰老潜力40，这些标志物包括细胞周期调控蛋白 p16Ink4A 和 p2141、衰老相.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AG043376（项目2和核心A，PDR；项目1和核心B，LJN）和AG056278（项目3和核心A，PDR；项目2，LJN）以及Glenn基金会资助项目（LJN）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 培养基 |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | 培养基 |
| 胎牛血清 | 组织培养生物制品公司 | 101 | 血清 |
| 1× 非必需氨基酸 | Corning | 25-025-Cl | 氨基酸 |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | 溶酶体抑制剂 |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | β-半乳糖苷酶底物 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA嵌插剂 |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90抑制剂 |
| InCell6000 细胞成像系统 | GE Healthcare | 高内涵成像系统 |
参考文献
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology....
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重印与许可
