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方法文章

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

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DOI：

10.3791/58237

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2018年6月14日

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1 (HPRT1)

摘要

CRISPR/Cas9 技术正在加速多种细胞类型的基因组编辑，但迄今为止，在原代自然杀伤（NK）细胞中实现基因递送和稳定的基因修饰仍具有挑战性。例如，使用慢病毒或逆转录病毒转导进行转基因递送，由于程序相关的 NK 细胞大量凋亡，导致基因工程化 NK 细胞的产量有限。本文介绍了一种无需 DNA 的基因组编辑方法，利用 Cas9 核糖核蛋白复合物（Cas9/RNPs）对人原代及扩增后的 NK 细胞进行编辑。该方法可高效敲除 NK 细胞中的 TGFBR2 和 HPRT1 基因。RT-PCR 数据显示基因表达水平显著降低，对代表性细胞产品的细胞毒性检测表明，RNP 修饰后的 NK 细胞对 TGFβ 的敏感性降低。电穿孔后的基因修饰细胞可通过经辐照表达 mbIL21 的饲养细胞刺激进行扩增。

引言

近年来，癌症免疫治疗取得了显著进展。基因改造的嵌合抗原受体（CAR）T细胞是工程化免疫细胞成功应用于癌症免疫治疗的典型范例。这些细胞最近已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。然而，目前的成功仅局限于少数具有可靶向抗原的疾病，而针对如此有限的抗原谱系容易因免疫逃逸而导致治疗失败。此外，由于异体T细胞可能引发移植物抗宿主病（GvHD），CAR T细胞治疗主要集中于自体T细胞的应用。相比之下，自然杀伤（NK）细胞能够以抗原非依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞，且不会引起GvHD，因此成为癌症免疫治疗的理想候选细胞6,7,8,9。

CRISPR/Cas9 技术最近已被用于免疫细胞的工程化改造，但利用质粒对自然杀伤（NK）细胞进行基因重编程一直具有挑战性。这主要是由于以DNA依赖方式递送外源基因存在困难，例如慢病毒和逆转录病毒转导会导致明显的操作相关性NK细胞凋亡，且基因工程化NK细胞的产量有限4,9。

许多天然免疫细胞表达高水平的病原体相关分子模式受体，例如视黄酸诱导基因I（RIG-I），这使其能够更有效地识别外源DNA。在使用基于DNA的基因修饰方法时，抑制这些通路可显著提高自然杀伤细胞（NK细胞）的转导效率10。

本文介绍了一种利用Cas9核糖核蛋白复合物（Cas9/RNPs）对原代及扩增的人自然杀伤（NK）细胞进行无DNA基因组编辑的方法。Cas9/RNPs由三个组分构成：重组Cas9蛋白与合成的单链向导RNA（包含结合的crRNA和tracerRNA）形成的复合物。由于Cas9/RNPs以功能性复合物形式递送，其对基因组靶点的切割效率高于依赖外源DNA的方法。此外，Cas9/RNPs在细胞内可快速清除，可能减少脱靶效应（如诱导细胞凋亡）。因此，该技术可用于实现基因敲除，或在结合同源重组DNA模板时实现基因敲入6,7。我们证明，通过电穿孔递送Cas9/RNPs是一种简便且相对高效的方法，克服了以往在NK细胞中进行遗传修饰所面临的技术限制。

TGFβ 是一种主要的免疫抑制性细胞因子，可抑制自然杀伤（NK）细胞的活化及其功能。已有研究提出，靶向 TGFβ 信号通路可增强免疫细胞的功能。我们针对编码 TGFβ 受体 2（TGBR2）胞外域的区域进行编辑，该区域能够结合 TGFβ11。代表性结果表明，该基因的 mRNA 表达水平显著降低，并进一步证明经修饰的 NK 细胞对 TGFβ 产生了抗性。此外，这些经修饰的细胞仍保持活力和增殖潜能，能够在电穿孔后利用经辐照的饲养细胞进行扩增。因此，以下方法是一种极具前景的遗传学操控 NK 细胞的技术，可用于进一步的临床或科研用途。

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方案

健康供体的血沉棕黄层由美国红十字会中俄亥俄地区中心提供作为源材料。该研究已由全美儿童医院机构审查委员会确定为豁免研究。

1. 人NK细胞的分离与扩增

  1. 从血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMC）12。
    1. 将35 mL血沉棕黄层样本叠加在15 mL Ficoll-Paque上。
    2. 以400 × g离心20分钟（不启用刹车），从界面收集PBMC。
    3. 用至少等体积的PBS重悬回收的PBMC，400 × g离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。此阶段可通过RosettesSep13分离自然杀伤（NK）细胞。
  2. 在第0、7和14天，使用经照射的表达mbIL21的饲养细胞（10 × 106个）刺激NK细胞以实现扩增。每隔一天更换新鲜培养基，培养基为含10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和100 IU/mL IL-2的RPMI完全培养基。

2. gRNA 设计与选择

  1. 使用在线工具选择特定的基因组位点进行靶向， 例如， NCBI，Ensemble
    示例。
    描述：转化生长因子β受体2（TGFBR2）胞外域
    查看记录：PF08917
    查看 InterPro：IPR015013
    位置：49 - 157 氨基酸
    靶向序列：TGFBR2 基因（ENSG00000163513）的第 4 外显子
  2. 使用 CRISPR 设计网络工具（如 http://crispr.mit.edu 和 ‘Benchling’）来设计 gRNA。
    1. 输入所选的 DNA 序列 步骤 2.1选择人类基因组（hg 19）作为目标基因组。将对先前输入的序列扫描CRISPR引导序列（20个核苷酸，后接PAM序列：NGG），并显示在整个选定基因组中可能的脱靶匹配位点。
    2. 根据靶上和脱靶率选择得分最高的三个gRNA。例如， 表1 显示了由CRISPR设计网络工具推荐的靶向TGFBR2基因第4外显子的CRISPR RNA设计序列。
  3. 订购合成的序列特异性crRNA作为CRISPR RNA。
  4. 订购一种保守的反式激活RNA（tracrRNA），该RNA通过与crRNA的部分同源性相互作用。

3. 设计缺失筛选引物

  1. 设计跨越gRNA切割位点的引物用于T7E1突变检测。
  2. 引物应至少距离预测切割位点100 bp，以确保在突变检测后，sgRNA靶位点处的小片段插入-缺失（indels）能够在1.5%琼脂糖凝胶上显现。表2列出了用于扩增TGFBR2胞外域的引物。

4. 人原代和扩增的NK细胞的转导

注意：使用 4D 系统通过电穿孔将 Cas9/RNP 元件转导至 NK 细胞，步骤如下。

  1. 细胞 准备
    1. 对于原代NK细胞，将新分离的NK细胞在含有100 IU/mL IL-2的RPMI培养基中培养4天，并在第5天进行电穿孔。按照前述方法每隔一天更换培养基，并在转导前一天换液。
    2. 用于扩增的NK细胞，于第0天以1:1的比例用经辐照的饲养细胞刺激细胞，并在第5、6或7天进行电穿孔。每隔一天更换一次培养基，具体操作如前所述，并在转导前一天更换培养基。
    3. 电穿孔当天，为接受电穿孔的细胞准备一个装有8 mL新鲜RPMI的T25培养瓶，其中含有100 IU/mL IL-2，并将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中预孵育。2 培养箱
      注意： 解冻的细胞或经历2次冻融的细胞nd 或 3rd 刺激可在细胞复苏后的任意时间通过电穿孔进行。
    4. 取 3 - 4 × 106 每种条件下 26 µL 转导混合物中的细胞数
      注意： 电穿孔溶液中自然杀伤细胞的浓度过高会提高转导效率。
    5. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，以去除所有通常含有 RNase 活性的 FBS。每次以 300 x g 离心 8 分钟。
      注意： 考虑7种Cas/RNP电穿孔条件，包括单个gRNA（gRNA1、gRNA2、gRNA3）、两种gRNA的组合（gRNA1+gRNA2、gRNA1+gRNA3、gRNA2+gRNA3），以及一个不含Cas9/RNP的对照组。
  2. 形成crRNA:tracerRNA复合物
    1. 重悬crRNA（gRNA1、gRNA2和gRNA3）以及tracerRNA于1x TE溶液中终浓度为200 μM。按所示方法，将2.2 μL的每种200 μM gRNA与200 μM tracerRNA混合 表3.
    2. 将样品在 95 °C 加热 5 分钟，然后在台面上冷却至室温（15 - 25 °C）。将重悬的 RNA 及 crRNA:tracerRNA/复合物于 -20 °C 保存，以备后续使用。
  3. 形成RNP复合物
    注意：     为节省时间，可在洗涤过程中形成RNP复合物 步骤 4.1.5.
    1. 对于单个crRNA:tracrRNA双链反应，将Cas9核酸内切酶稀释至36 μM，示例如下所示 表4.
    2. 对于crRNA:tracrRNA双链的组合转导，将Cas9核酸酶稀释至36 μM，示例见 表5.
    3. 将Cas9核酸酶缓慢加入crRNA:tracrRNA双链复合物中，同时轻轻涡旋移液枪头，持续30秒至1分钟。
    4. 将混合物在室温下孵育15 - 20分钟。若孵育后暂不使用，应将混合物置于冰上直至使用。
  4. 电穿孔
    1. 将全部添加剂加入电穿孔溶液 P3 中，并在室温下保存。
    2. 重悬细胞沉淀（3 - 4 × 106 细胞来自 步骤 4.1.5) 加入20 μL P3原代4D电穿孔溶液中。移液时避免产生气泡。
      注意细胞不应在P3溶液中放置过长时间。
    3. 立即向细胞悬液中加入5 µL RNP复合物（步骤4.3）。
    4. 向 Cas9/RNPs/细胞混合物中加入 1 μL 的 100 μM Cas9 电穿孔增强剂。
    5. 将Cas9/RNPs/细胞混合物转移至20 μL电穿孔槽中。
    6. 轻轻敲击试条，确保样本覆盖试条底部。
    7. 启动4D电穿孔系统并选择 EN-138 程序

5. 转导后处理

  1. 将细胞在条带中静置 3 分钟。
  2. 向比色皿中加入 80 µL 预先平衡的培养基，并轻轻将样品转移至培养瓶中。
  3. 转导后 48 小时，从 5 × 105 个细胞中提取基因组 DNA，用于基因敲除筛选。
  4. 使用步骤 3.2 中设计的引物，通过 Taq DNA 聚合酶试剂盒扩增目标基因。
  5. 形成用于 T7EI 消化的 PCR 扩增子异源双链体，并在 37 °C 下用 T7EI 酶孵育 30 - 60 分钟。
    注意：与使用 Surveyor 检测相比，T7EI 检测因其快速、简便且能提供清晰的电泳结果而更适用于筛选。然而，该方法无法检测 Cas9 RNP 实验中由非同源末端连接（NHEJ）活性产生的少于 <2 个碱基的插入和缺失14。
  6. 将消化后的 DNA 在 1.5% 琼脂糖凝胶中以 110 V 电泳 30 - 45 分钟，每 15 分钟观察一次凝胶。
  7. 用表达 mbIL21 的饲养细胞以 1:1 的比例刺激剩余细胞。
  8. 刺激后第五天，使用 qPCR 提取 RNA 以检测基因表达水平。
  9. 按照先前报道的方法进行钙黄绿素检测12。简言之，用钙黄绿素 AM 负载靶细胞（在所示示例中，使用 3 µg/mL/1,000,000 个 DAOY 细胞）。通过在含或不含 10 ng/mL 可溶性 TGFβ 的 IL2（100 IU/mL）中过夜静置，准备用于细胞毒性检测的 NK 细胞。钙黄绿素检测应在与 NK 细胞过夜静置时相同的细胞因子条件下进行。

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结果

电穿孔效率

为了优化Cas9/RNP对NK细胞的电穿孔转染效果，我们测试了16种不同的电穿孔程序，分别将GFP非靶向siRNA和DNA质粒导入NK细胞。流式细胞术检测结果显示，程序EN-138在细胞存活率和转染效率方面均表现最佳，两种颗粒的活细胞中GFP阳性细胞比例均达到35%（图1 ＆ 图2）。有趣的是，使用该程序进行Cas9/RNP电穿孔时，转染效率更高，TGFBR2 mRNA表达水平降低了60%（图5）。此外，基因修饰后的NK细胞可培养扩增达30天，并可进行冷冻保存（数据未显示）。

突变检测实验

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讨论

依赖DNA的NK细胞修饰一直具有挑战性4,9。因此，我们直接将体外合成的核糖核蛋白（RNPs）复合物以及纯化的Cas9蛋白以蛋白质形式导入原代和扩增后的NK细胞中8。该方法使我们能够避免由RNA聚合酶II启动的加帽、加尾以及其他转录和翻译过程，从而减少与依赖DNA的转导方法相关的NK细胞凋亡。

此外，本文报道的方法采用纯化的 Cas9 蛋白形成 Cas9/RNP 复合物，该复合物在电转染后立即具有活性，并且可快速降解，从而相较于现有方案显著提高靶向效率并降低脱靶效应5,6,7,16。进一步地，本文引入了一种优化的新型电转染方法，可高效转导 Cas9/RNP 复合物，...

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披露

DAL 曾担任 Courier Therapeutics、Obsidian Therapeutics、Intellia Therapeutics、Merck Research Laboratories 和 Miltenyi Biotec 的顾问，并在 CytoSen Therapeutics 拥有股权/担任领导职务。

致谢

我们感谢 Brian Tullius 在编辑手稿过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RosetteSep™ 人自然杀伤细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies15065RosetteSep™ 人NK细胞富集混合液旨在通过阴性选择法从全血中分离NK细胞。
Ficoll-Paque® PLUSGE Healthcare - 生命科学17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA Technologies1072532含有专有化学修饰的tracrRNA，可增强核酸酶抗性；与crRNA杂交以激活Cas9酶
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNAIntegrated DNA Technologies人工合成的 Alt-R® 靶向目的基因的CRISPR-Cas9 crRNA，基于设计的gRNA序列
Alt-R® 基因组编辑检测试剂盒Integrated DNA Technologies1075931每个试剂盒包含T7EI内切酶、T7EI反应缓冲液和T7EI检测对照品。
铂® 高保真Taq DNA聚合酶Invitrogen11304-011
4D-Nucleofector™ 系统LonzaAAF-1002B
人重组IL-2蛋白诺华65483-0116-07
P3 原代细胞 4D-电转染仪™ X试剂盒LonzaV4XP-3032含有 pmaxGFP™ 载体，核转染器™ 溶液，补充剂，16孔核电穿孔杯™ 条带
非靶向：定制 siRNA，标准 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9核酸酶
DNeasy® 血液 &与组织手册Qiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AM赛默飞世尔科技C3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 对照试剂盒，人源Integrated DNA Technologies1072554包含tracrRNA、HPRT阳性对照crRNA、阴性对照crRNA#1、HPRT引物混合液和无核酸酶双链缓冲液。
IDTE pH 7.5（1X TE 溶液）Integrated DNA Technologies11-01-02-02
Alt-R® Cas9 电穿孔增强剂Integrated DNA Technologies1075915Cas9 电穿孔增强剂

参考文献

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