Summary

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Describimos el desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro con dihidrotestosterona pelotilla para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como SOP.

Abstract

Hyperandrogenemia juega un papel fundamental en la función reproductiva y metabólica en las hembras y es el sello distintivo del síndrome de ovario poliquístico. Desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro que imita a las mujeres con SOP es clínicamente significativo. En este protocolo, se describe dicho modelo. Mediante la inserción de una longitud de 4 mm de pastilla de polvo de cristal DHT (dihidrotestosterona) (longitud total de la pelotilla es 8 m m), y reemplazarlo cada mes, que son capaces de producir un modelo de ratón de SOP-like con doblez de 2 los niveles DHT suero mayor que los ratones no implantados con DHT (no-DHT). Se observó disfunción reproductiva y metabólica sin cambiar el peso corporal y composición corporal. Mientras que exhibe un alto grado de infertilidad, un pequeño subconjunto de estos ratones hembra SOP-como puede quedar embarazado y sus hijos muestran retraso de la pubertad y aumento de la testosterona como adultos. Este modelo de ratón magro como PCOS es una herramienta útil para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como PCOS.

Introduction

Hiperandrogenismo es el síndrome de ovario poliquístico (SOP) según los criterios del NIH y del exceso de andrógenos y SOP (AE-SOP) la sociedad. Las mujeres con SOP tienen dificultad para quedar embarazadas y han aumentado el riesgo de embarazo complicaciones1. Incluso si consiguen embarazadas, su descendencia femenina tiene una de2,de los resultados adversos para la salud3. Se han desarrollado modelos animales usando varias estrategias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 y exhibe muchas características del SOP (anovulación, y tolerancia deteriorada de la glucosa y la insulina) con mayor peso corporal y obesidad había asociada con el tamaño del adipocito agrandado y aumentó el peso del adipocito. Hay dos estrategias principales para producir modelos de animales que se utilizan para el estudio de PCOS. Uno es el tratamiento con altos niveles de andrógenos directamente (inyección de andrógenos exógenos, inserción) o indirectamente (por ejemplo, bloqueando la conversión de andrógenos a estrógenos con inhibidor de la aromatasa) después nacimiento13. Otro es por hyperexposure fetal de andrógenos durante la gestación14,15 estudiar la descendencia. Por ejemplo, la hembra crías de mono rhesus16,17, ovejas18y roedores expuestos a niveles masculinos de andrógenos durante el período intrauterino desarrollan SOP-como rasgos más adelante en la vida. Estos modelos habían mejorado significativamente nuestra comprensión de los efectos de andrógenos elevados y programación fetal y uterinos efectos ambientales. Sin embargo, estos modelos tienen sus propias limitaciones: 1) los animales desarrollan obesidad y por lo tanto es difícil separar los efectos del hyperandrogenemia reproductiva inducida por la obesidad y la disfunción metabólica; 2) antes del embarazo, las mujeres con SOP ya exhiben altos niveles de andrógenos, así ovocitos han sido expuestos a andrógenos en exceso antes de la fecundación; 3) las dosis farmacológicas de la testosterona (T) o dihidrotestosterona (DHT) usado después del nacimiento o durante la gestación pueden no reflejar el ambiente de andrógeno de PCOS. Se han medido los niveles de testosterona y DHT en suero y en líquido folicular ovárico y testosterona y los niveles DHT son 1.5 a 3.9 veces mayor en mujeres con SOP5,19,20,21 ,22,23 en comparación con las mujeres. Hemos creado un ratón adulto modelo23,24,25 que se desarrolla la disfunción reproductiva y metabólica dentro de dos semanas de la iniciación de la exposición crónica de DHT de la inserción de un pellet con 4 mm de longitud de polvo de cristal DHT (longitud total de la pelotilla es 8 m m). Este modelo produce suero DHT niveles sobre 2 superior (denominado 2xDHT) que el de los ratones de control sin tratamiento de DHT. Los ratones 2xDHT no presentan alteraciones del estradiol del suero basal, testosterona, LH y no no desarrollar obesidad y muestran similar peso ovárico, los niveles séricos de colesterol, ácidos grasos libres, leptina, TNFα y IL-623,24, 25 relativas a controles hasta 3,5 meses después de DHT inserción23,24,25. Además, por el apareamiento de las hembras que ya han desarrollado características del SOP, podemos estudiar el impacto de un ambiente materno hyperandrogenic en la salud metabólica y reproductiva de la descendencia15.

Este nuevo paradigma (pertinente a los criterios NIH y sociedad AE-SOP) modelos de la enfermedad mediante la producción de niveles relativamente similares de andrógenos a las mujeres con SOP 2 – 3-fold mayor testosterona o niveles de DHT en comparación con las mujeres. Sin embargo, este modelo se mantiene por DHT exógena continua y no de hiperandrogenismo endógeno programada, una vez que se retira el DHT. El objetivo general de este artículo es concentrarse en 1) Cómo hacer que el perdigón DHT; 2) Cómo generar un SOP lean como modelo de ratón; 3) estrategias para evaluar la descendencia femenina de estas represas. Otras medidas y la evaluación de fenotipos no se abordan en este manuscrito, pero pueden encontrarse en5,15,23,24,25,26.

Protocol

Aquí, presentamos protocolos detallados para la inserción y preparación de pellets DHT y para la prueba metabólica y reproductiva. Los ratones utilizados en este estudio fueron un fondo mixto (C57/B6, CD1, 129Sv) y se mantuvieron con alimento y agua ad libitum en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h a 24 ° C en las instalaciones de edificio de Broadway de investigación animal en la Facultad de Universidad de Johns Hopkins de Medicina. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Comisión de uso y de J…

Representative Results

Niveles de DHT y prueba de tolerancia a la glucosa Niveles de DHT se midieron de suero recolectado por tanto ELISA y por LC-MS según protocolo 1.24, 1.25 y 2.9, 3.0. Los valores absolutos DHT son diferentes entre espectrometría de masas y ELISA, sin embargo, el repliegue relativo (aproximadamente 2 veces) de vs DHT DHT no es similar de ambos ensayos y a través de experimentos de15,<sup class="x…

Discussion

Hiperandrogenismo es una característica clave de PCOS. Los niveles séricos DHT (dos veces más en ratones DHT que en ratones no-DHT) utilizados en este protocolo son inferiores a los reportados por otros investigadores en estudios previos y están calibrados para imitar proporcionalmente las mujeres con SOP5,19, 20,21. A diferencia de otros modelos, este modelo DHT 2 veces no altera el peso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (subvenciones R00-HD068130 a S.W.) y el centro de investigación de Diabetes de Baltimore: pilotos y viabilidad subsidio (S.W.).

Materials

Crystalline 5α-DHT powder   Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter
Medical adhesive silicone  Factor II, InC.  A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
 10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
  Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring  Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
 attached needle: 20G BD 305176
 Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. 
Xylazine  Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100mg/ml
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100mg/ml
 Surgical staple  AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
 Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
 Trochar  Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Supplier Diversity Partner
Manufacturer:  Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life
Animal tattoo ink paste Ketchum manufacturing Inc. Brockville, Ontario, Canada
Scale Ohaus Corporation  HH120D Pine Brook, NJ
Electronic digital caliper NEIKO Tools USA 01407A available from Amazon

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Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

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