هنا يمكننا وصف أسلوب فوتوبليتشينج للحد من أوتوفلوريسسينسي من البكتيريا الزرقاء. بعد فوتوبليتشينج، يستخدم الميكروسكوب التعمير البصرية العشوائية للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة القرار من الحلبة فتسز سيانوباكتيريال.
مجهرية فائقة القرار قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين البروتينات وهياكل سوبسيلولار في العديد من الكائنات الحية. في الكائنات الحية التمثيل الضوئي، بيد القرار الأفقي لتصوير فائقة القرار هو فقط 100 ~ شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض القرار يرجع أساسا إلى خلفية أوتوفلوريسسينسي عالية من التمثيل الضوئي الخلايا الناجمة عن أشعة الليزر عالية الكثافة المطلوبة لتصوير فائقة القرار، مثل إعادة الإعمار البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة). هنا، يمكننا وصف ساعد فوتوبليتشينج عاصفة أسلوب الذي تم تطويره مؤخرا للتصوير بيكوسيانوباكتيريوم البحرية بروتشلوروكوككوس. بعد فوتوبليتشينج، أوتوفلوريسسينسي من بروتشلوروكوككوس يتم تقليل فعالية حتى يمكن تنفيذ تلك العاصفة بدقة أفقية ~ 10 نانومتر. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن اكتساب المنظمة في فيفو ثلاثية الأبعاد (3-D) من البروتين فتسز وتميز أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز مختلفة خلال دورة الخلية بروتشلوروكوككوس. ويمكن اعتماد الأسلوب يصف لنا هنا لتصوير القرار فائقة للكائنات الحية الأخرى التمثيل الضوئي.
ميكروسكوبيس القرار فائقة يمكن كسر الحد حيود الضوء وتوفير الصور ضمن قرارات حيود الفرعية (< 200 nm). قد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الكائنات الحية لدراسة البروتين التعريب والهياكل سوبسيلولار. الرئيسية فائقة القرار تشمل أساليب الفحص المجهري منظم إضاءة مجهرية (SIM)، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED) والعاصفة فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل). الآليات والتطبيقات هذه القرار فائقة المجاهر وقد استعرضت في أماكن أخرى1،2.
العاصفة يمكن التوصل إلى قرار يصل إلى 10 نانومتر بالفصل المكاني3،4. للعاصفة، يتم تنشيط جزيء واحد فقط داخل منطقة حيود محدودة (“في”) ويتم الاحتفاظ بباقي الجزيئات المعطل (“إيقاف”). بتراكم للتبديل السريع على–والخروج من الجزيئات واحدة، يمكن أن تكون صورة “حيود غير محدود” ولدت3. ومن ناحية أخرى، قابلة للتطبيق في العاصفة، والسماح بترقية سهلة من الفحص المجهري الفلورية العادية للفحص المجهري عالية الدقة5،6أنواع كثيرة من الأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية.
العاصفة لم تطبق على نطاق واسع في الخلايا التمثيل الضوئي، مثل البكتيريا، الطحالب، والخلايا النباتية مع المعايشة7،8، وهو يرجع ذلك إلى حقيقة أن العاصفة يتطلب كثافة الليزر عالية إلى فوتوسويتشينج بالسيارة. الليزر عالية الكثافة ظالم يثير الخلفية أوتوفلوريسسينسي قوية في خلايا التمثيل الضوئي ويتداخل مع التعريب جزيء واحد في تصوير العاصفة. من أجل استخدام العاصفة إلى التحقيق فيها الهياكل سوبسيلولار أو تفاعلات البروتين في خلايا التمثيل الضوئي، قمنا بتطوير بروتوكول فوتوبليتشينج لإخماد إشارات أوتوفلوريسسينسي الخلفية9. في إجراءات روتينية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت، تتعرض العينات للضوء الأبيض كثافة عالية خلال الخطوة الحظر، مما يقلل من أوتوفلوريسسينسي الخلايا التمثيل الضوئي لتلبية المتطلبات للعاصفة. وهكذا، هذا البروتوكول يجعلها ممكنة التحقيق في الكائنات الحية المصطبغة بالعاصفة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام العاصفة بصورة منظمة عصابة فتسز في بيكوسيانوباكتيريوم أحادي الخلية بروتشلوروكوككوس. FtsZ هو بروتين cytoskeletal مصانة عالية مثل tubulin الذي بوليميريزيس لتشكيل هيكل الدائري (الطوق Z) حول محيط الخلية10 وهو ضروري ل انقسام الخلية11. الحفاظ على بروتشلوروكوككوس الخلايا فوتوبليتشيد الأولى للحد من الخلفية أوتوفلوريسسينت وإيمونوستينيد مع جسم FtsZ مكافحة الأولية، وثم جسم مفتش (H + L) المضادة أرنب ثانوية مترافق مع فلوروفوري (مثلاً ، أليكسا فلور 750). في نهاية المطاف، يتم استخدام العاصفة لمراقبة المنظمات خاتم فتسز مفصلة في بروتشلوروكوككوس خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية.
نحن الموصوفة في هذا البروتوكول، على إجراء خفض كبير في أوتوفلوريسسينسي سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس (الشكل 3)، وبعد ذلك، إيمونوستين البروتينات في الخلايا، مما مكننا من الاستفادة من العاصفة دراسة فتسز ثلاثي الأبعاد خاتم مورفولوجيس في بروتشلوروكوككوس (<strong class="…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون شو داييينج لها المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة. ويدعم هذه الدراسة المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (المشروع رقم 41476147) و “مجلس منح البحوث” “منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة”، الصين (المشروع رقم 689813 و 16103414).
Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
PBS | Sigma | P3813 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |