Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro

Summary

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pasos experimentales detallados de un tratamiento de plasma atmosférico frío sobre las células madre neurales y detección de inmunofluorescencia para la mejora de la diferenciación.

Abstract

Como el desarrollo de la tecnología de plasma físico, frío atmosféricos plasmas (CAPs) han sido ampliamente investigados en descontaminación, tratamiento contra el cáncer, la cicatrización de heridas, tratamiento de conducto, etc., formando un nuevo campo de investigación llamado medicina del plasma. Siendo una mezcla de especies reactivas eléctricas, químicas y biológicas, casquillos han demostrado sus habilidades para mejorar la diferenciación de las células madre de nervio tanto en vitro y en vivo y se está convirtiendo en un camino prometedor para el tratamiento de la enfermedad neurológica en el futuro. La noticia más emocionante es que usando tapas de puede realizar un solo paso y dirigido con seguridad, diferenciación de las células madre neurales (NSC) para el transporte de tejido. Aquí demostramos el protocolo experimental detallado usando un dispositivo de tapa jet hecho a sí mismo para mejorar la diferenciación de la NSC en C17.2 NSCs y las células madre neurales primarios de rata, así como el destino de la célula por invertida y microscopía de fluorescencia. Con la ayuda de la inmunofluorescencia que manchaba la tecnología, encontramos tanto las NSCs mostró un ritmo acelerado de la diferencia que el grupo no tratado, y ~ 75% de las NSCs selectivamente diferenciado en neuronas, que son principalmente maduros, colinérgicos y motor neuronas.

Introduction

La diferenciación dirigida de NSC en un cierto linaje para el transporte de tejido es considerada uno de los más prometedores tratamientos para enfermedades de neurodegenerative y neurotraumatic¹. Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas catecolaminérgica se desean especialmente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, los métodos tradicionales para preparar las células deseadas para el transporte tienen muchos inconvenientes, tales como toxicidad química, formación de la cicatriz u otros, que dificulta en gran medida las aplicaciones de NSCs en medicina regenerativa². Por lo tanto, es muy necesario encontrar una manera novedosa y segura para la diferenciación de la NSC.

El plasma es el cuarto estado de materia, siguiente sólido, líquido y gas, y constituye más del 95% de casos en todo el universo. Plasma es eléctricamente hilo neutro positivos o negativos y partículas neutras y normalmente es generado por una descarga de alto voltaje en el laboratorio. En las últimas dos décadas, la aplicación de plasma en biomedicina ha atraído gran atención en todo el mundo como el desarrollo de la tecnología de plasma frío la presión atmosférica. Gracias a esta técnica, plasma de baja temperatura estable se puede generar en el aire en la atmósfera sin la formación de arco y consta de diversas especies reactivas, tales como las especies reactivas del nitrógeno (RNS), especies reactivas del oxígeno (ROS), ULTRAVIOLETA (UV) radiación, electrones, iones y campo eléctrico³. Tapas tienen ventajas únicas para la inactivación de microorganismos, terapia del cáncer, de heridas, tratamiento de enfermedades de la piel, la proliferación celular y diferenciación celular^4,5,6,7. En trabajos previos, hemos demostrado que chorro de plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de NSCs en células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) y las células madre neurales primarios de rata, exhibiendo un gran potencial para convertirse en una poderosa herramienta para la dirección diferenciación de NSCs⁸. Aunque el mecanismo de mejora de la tapa de la diferenciación del NSC no se entiende completamente sin embargo, NO generado por los casquillos ha demostrado para ser un factor clave en el proceso. En este trabajo, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo experimental detallado del uso de un plasma de helio/oxígeno de presión atmosférica jet para el tratamiento de NSCs en vitro, preparación de la célula y tratamiento previo, observación de morfología por microscopio invertido, y observación de la microscopia de fluorescencia de la tinción de inmunofluorescencia.

Protocol

1. culturas y Predifferentiation de la célula Predifferentiation y cultivo de células madre neuronales Preparar el cubreobjetos de poly-D-lisina-revestida. Poner un cubreobjetos estéril (20 mm de diámetro) en una placa de 12 pozos. Capa del cubierta de vidrio con poly-D-lisina, 0.1% w/v, en el agua (Tabla de materiales) para mejorar la adherencia de la célula en el cubreobjetos siguiendo los siguientes pasos.Nota: Las condiciones óptimas se deben determinar…

Representative Results

Morfología de la célula se observó bajo el microscopio invertido cada día después del tratamiento de la tapa. La figura 2 muestra las imágenes de microscopio invertido de contraste de fase ordinaria de la diferenciación celular en ambas líneas celulares. El grupo tratado con plasma exhibe una tasa de diferenciación acelerada y una relación de alta diferenciación en comparación con el grupo de flujo de gas y control. <p class=…

Discussion

C17.2-NSC es una especie de línea de células neuronales inmortalizadas de células de la capa granular cerebelosa de ratón neonatal, desarrollado por Snyder y otros^10,11. C17.2-NSC puede diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y es ampliamente utilizado en Neurociencia¹². En nuestro estudio anterior, tapas podrían mejorar la diferenciación de NSCs C17.2 en neuronas. Un estudio de prueba de principio también llevó a …

Materials

Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A