使用手动分选与双细胞剔除法对荧光标记小鼠神经元进行单细胞RNA测序 体外 具有绝对计数测序的转录组分析（DIVA-Seq）

摘要

本方案描述了手动分选单个荧光标记神经元的步骤，随后进行 体外 基于转录的mRNA扩增技术用于高深度单细胞RNA测序

摘要

单细胞RNA测序（RNA-seq）现已成为检测基因表达的常用工具。市面上可获得的单细胞RNA测序平台会无差别地处理所有输入细胞。有时会在上游使用荧光激活细胞分选（FACS）来分离特定标记的目标细胞群体。FACS的一个局限性在于需要大量输入细胞，并且其中被显著标记的细胞比例需足够高，这使得从鼠脑中收集和分析稀有或稀疏标记的神经元群体变得不切实际。本文介绍一种从新鲜解离的小鼠脑组织中手动收集稀疏荧光标记单个神经元的方法。该方法可实现高纯度捕获单个标记神经元，并可进一步与后续分析流程整合。 体外 一种基于转录的扩增方案，可保留内源性转录本的比例。我们描述了一种利用独特分子标识符（UMIs）生成单个mRNA计数的双线性扩增方法。经过两轮扩增，可实现每个单细胞中高程度的基因检出。

引言

单细胞RNA测序（RNA-seq）已彻底改变了转录组学研究。尽管可采用多种技术（如液滴法）进行大规模单细胞RNA测序^1,2，微流控技术³，纳米网格⁴和微孔⁵，大多数方法无法分选表达遗传编码荧光蛋白的特定细胞类型。为了分离特定的细胞群体，通常采用荧光激活细胞分选（FACS）以单细胞模式对标记细胞进行分选。然而，FACS存在一些限制，并需要精细的样品处理步骤。首先，通常需要大量的起始细胞（每毫升常需数百万个细胞），其中相当一部分细胞>15–20%）含有标记细胞群。其次，细胞制备可能需要多次密度梯度离心步骤，以去除胶质成分、碎片及可能堵塞喷嘴或流动池的细胞团块。第三，流式细胞分选（FACS）通常需对活/死细胞染色进行染色与脱色步骤例如， 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）和Cytotracker染料），这些步骤会额外耗时。第四，对于双色分选（例如DAPI与绿色/红色荧光蛋白GFP/RFP），通常需要两个样品和一个对照，除目标小鼠品系外，还需处理一个未标记的样品。第五，为预防流式细胞分选仪（FACS）样品管路堵塞，通常在分选前和分选过程中需多次进行过滤。第六，在大多数常用的FACS系统中，必须预留时间用于初始化和稳定液流，并进行液....

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得纽约冷泉港实验室动物护理与使用委员会（IACUC #16-13-09-8）的批准。

1. 荧光标记小鼠神经元的手动分选

1. 使用拉针仪将玻璃微毛细管（参见材料表）拉制成出口直径为10–15 µm的微电极，拉制参数设置如下：加热温度：508，拉力：空白，速度：空白，时间：空白。
2. 使用合适的管路连接件，将一段长度为120–150 cm的柔性硅胶管（内径约0.8 mm）连接至一个0.2 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射过滤器和一个双向管路阀。
3. 准备500 mL冰冷（4 °C）的人工脑脊液（ACSF，表1），并通过气石向其中通入含5%二氧化碳的平衡氧气气体15分钟，或直至溶液完全澄清，以实现氧合。
4. 在150 mL烧杯中配制100 mL含活性阻断剂混合物的ACSF（表1）。
5. 在150 mL烧杯中配制100 mL含1 mg/mL Streptococcus IV型蛋白酶的ACSF（表1）。
6. 在150 mL烧杯中配制100 mL含1%胎牛血清（FBS）的ACSF，并通过气石持续通入含5%二氧化碳的平衡氧气进行氧合。
7. 通过使用小剪刀打开安乐死小鼠的颅骨，并用精细镊子取出完....

结果

采用上述方案，对GABA能神经元进行手动分选（图1）并扩增RNA，然后构建cDNA文库（图2）并在高深度下进行测序⁸扩增的RNA（aRNA）产物大小在200–4,000 bp之间，峰值分布略高于500 bp（图3A）。经磁珠纯化的cDNA文库通过第二轮磁珠纯化进一步进行片段大小筛选，去除小于200 bp的较小片段（图3B 和 3C）并在约 350 bp 处出现峰值。片段过短会导致空读（无 mRNA 插入片段，仅有接头和引物序列），而片段过长则会占据测序芯片上更多空间，从而降低总读长产出。测序时，我们通常获得 4.8 x 10⁵ 中位数，或 6.9 x 10⁵ 每个细胞的平均比对读段数

讨论

手动分选方案适用于对小鼠脑中稀疏标记的神经元群体或极为稀少的细胞群体进行有监督的RNA测序，这些细胞群体通常难以通过现有的高通量细胞分选和扩增方法进行研究。经流式细胞分选（FACS）的细胞通常会受到鞘液和样品管路压力的影响，压力范围约为9–14 psi，具体数值取决于喷嘴尺寸和期望的事件速率。此外，细胞在从喷嘴喷出后可能猛烈撞击收集管或涂有样品缓冲液的孔板表面，从而造成冲击应力。而在手动分选过程中，由于细胞通过毛细作用被吸入移液管，并通过轻柔吹出及简单折断玻璃移液管尖端的方式释放，因此不会受到上述高压影响。DIVA-Seq方案适用于细胞体积较小（<8 µL）且起始材料量低的细胞进行RNA扩增，能够稳定地检测到大量基因（8–10 K），结合深度测序，可实现对细胞身份背后细胞功能分子图谱的精细重建^8,13,14。由于该方法具有细胞收集纯度高、基因检测灵敏度高以及能够进行绝对分子计数等优势，因此在高深度和高精度研究细胞状态及疾病病理生理机制方面具有重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ERCC RNA 加标对照混合液	赛默飞世尔科技	货号 4456740
SuperScript III	赛默飞世尔科技	货号 18080093
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂	赛默飞世尔科技	货号 10777019
RNA片段化缓冲液	New England Biolabs	货号 E6105S
RNA MinElute试剂盒	Qiagen	货号 74204
南极磷酸酶	New England Biolabs	货号 M0289
多核苷酸激酶	New England Biolabs	货号 M0201
T4 RNA连接酶2，截短型	New England Biolabs	货号 M0242
Ampure Xp 磁珠  珠粒	贝克曼库尔特	货号 A63880
SPRIselect 大小选择磁珠	赛默飞世尔科技	货号 B23317
DL-AP5	Tocris	货号 0105
CNQX	Tocris	货号 1045
TTX	Tocris	货号 1078
灰色链霉菌蛋白酶	Sigma-Aldrich	货号 P5147
Message Amp II 试剂盒	赛默飞世尔科技	货号 AM1751
碳合气	Airgas	货号# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	货号 761036
Illumina TrueSeq smallRNA 试剂盒	Illumina	货号 RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico 芯片	安捷伦	Cat# 5067-1513
生物分析仪高灵敏度DNA芯片	安捷伦	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	安捷伦
配备荧光和明场照明及微分干涉差（DIC）光学系统的解剖显微镜。  （徕卡型号 MZ-16F）	Leica	Model MZ-16F
玻璃微量移液管：硼硅酸盐毛细管，500支/包。外径=1 mm，内径=0.58 mm，壁厚=0.21 mm，长度=150 mm。	沃纳仪器	型号 GC100-15，货号 30-0017
毛细管移液器拉制仪	Sutter Instruments Co	P-97
振动切片机	Thermo Microm	HM 650V
振动切片机组织冷却装置	Thermo Microm	CU 65